β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术DB37／T 4415—2021.pdf

ICS 67.050 CCS X 04 37 山东省地方标准 DB 37/T 4415 2021-乳球蛋 白基因敲 除奶牛的 鉴定及牛 奶中-乳球蛋 白的检测 技术 Detection of-lactoglobulin gene knockout cow and-lactoglobulin in cows milk 2021-10-18 发布 2021-11-18 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB 37/T 4415 2021 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB 37/T 4415 2021 1-乳 球蛋白 基因敲 除奶牛 的鉴定及 牛奶中-乳球 蛋白的 检测技术 1 范围-BLG PCR-BLG Western-Blot ELISA-BLG-2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 19495.2 GB/T 27403 GB/T 27642 2011 DNA NY/T 1663 2008-NY/T 1672 2008 FecB NY/T 2695 2015 SN/T 2497.16 2010 16 Western-Blot 2031-14-2013(Bos taurus)PCR 3 术语和 定义 3.1 牛-乳球 蛋白 基因 Bos taurus-lactoglobulin BLG BLG NCBI Reference sequence:NC_037338.1 PAEP Bos taurus-注：4 900 bp 7 6 252 3.2-乳 球蛋 白基 因敲 除奶 牛-lactoglobulin knockout cow-4 聚合酶 链式 反应（PCR）法-基因 定性 检测 原理 4.1 BLG DNA BLG BLG DB 37/T 4415 2021 2 试剂或 材料 4.2 4.2.1 GB/T 6682 4.2.2 50 TAE Tris-base 242.2 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)100 mL 1 000 mL 1 TAE 4.2.3 1%1 g 1 TAE 100 mL 4.2.4 BLG 5-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3 5-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3 6 728 bp 4.2.5 2031-14-2013 4.2.6 10 mol/L 仪器设 备 4.3 4.3.1 PCR 4 99 20 96 0.2 mL 4.3.2 12 000 r/min 24 2 mL 4.3.3 0.001 g 100 g 0.001 g 4.3.4 4.3.5 0 V 600 V 0 mA 100 mA 4.3.6 45 135 0.255 Mpa 4.3.7 样品 4.4 4.4.1 3 mL 5 mL ACD-20 4.4.2 0.1 g 0.3 g 75%-20 4.4.3 20 30 75%-20 4.4.4 0.2 mL 0.5 mL 1 2 试验步 骤 4.5 4.5.1 DNA 提取 DNA GB/T 27642 2011 B 4.5.2 DNA 浓 度和 纯度 检测 DNA NY/T 1672 2008 7.3 4.5.3 PCR 扩增 4.5.3.1 样品PCR 扩增 4.5.3.1.1 内标准 基 因PCR 扩增 2031-14-2013 4.5.3.1.2 基因特 异性 序 列 PCR 扩增 DB 37/T 4415 2021 3 4.5.3.1.2.1 PCR Taq DNA 0.5 L 2 PCR buffer 25 L dNTP Mixture(2.5 mM)8 L(10 M)1.0 L DNA 200 ng 1 g 50 L 4.5.3.1.2.2 PCR 94 1 min 94 30 s 52 30 s 72 6 min 35 72 10 min 4 4.5.3.2 对照PCR 扩增 DNA A 16 bp BLG DNA B DNA PCR 4.5.3.1.2 4.5.4 PCR 产 物琼 脂糖 凝胶 电泳 检测 NY/T 2695 2015 6.4.2 4.5.5 测序分 析 PCR 结果判 定与 表述 4.6 4.6.1 对照检 测结 果分 析 PCR BLG PCR 4.6.2 样品检 测结 果判 定和 表述 PCR-A 4.6.2.1 BLG 4.6.2.2 BLG 5 免疫印 迹（Western-Blot）法-蛋白 定性 检测 原理 5.1-试剂或 材料 5.2 5.2.1 GB/T 6682 5.2.2-10 mg/mL 0.1 g-10 mL-20 5.2.3 10%SDS 10 g SDS 80 mL 100 mL 5.2.4 30%29 g 1 g N,N-60 mL 100 mL DB 37/T 4415 2021 4 5.2.5 1.5 M Tris-HCl(pH8.8)181.65 g Tris 800 mL pH 8.8 1 000 mL 5.2.6 1 M Tris-HCl(pH=6.8)121.1 g Tris 800 mL pH 6.8 1 000 mL 5.2.7 10%10 g 80 mL 100 mL 5.2.8 15%SDS-PAGE 5 mL 1.1 mL 2.5 mL 30%1.3 mL 1.5 M Tris-HCl(pH8.8)0.05 mL 10%SDS 0.05 mL 10%0.002 mL TEMED 5.2.9 5%SDS-PAGE 2 mL 1.4 mL 0.33 mL 30%0.25 mL 1.0 M Tris-HCl(pH6.8)0.02 mL 10%SDS 0.02 mL 10%0.002 mL TEMED 5.2.10 10 500 mL 15.1 g Tris 75 g 500 mL 5.2.11 10 TBS 1 L 88 g 12.1 g Tris 1 L pH 7.6 5.2.12 1 TBST 1 L 100 mL 10 TBS 899 mL 1 mL 20 5.2.13 BCA 5.2.14 ECL 仪器设 备 5.3 5.3.1 12 000 r/min 24 2 mL 5.3.2 0.001 g 100 g 0.001 g 5.3.3 45 135 0.255 Mpa 5.3.4-10 100 5.3.5 0 V 600 V 0 mA 100 mA 5.3.6 5.3.7 样品 5.4 5.4.1 液态样 品 50 mL 12 000 g 5 min-80 5.4.2 固态样 品 5 g 50 mL 5.4.1 试验步 骤 5.5 5.5.1 样品蛋 白浓 度测 定 BCA 5.5.2 样品制 备 30 g-1 g-5 SDS-PAGE 100 10 min 5.5.3 十二烷 基磺 酸钠-聚 丙烯 酰 胺凝胶 电泳（SDS-PAGE）NY/T 1663 2008 SDS-PAGE DB 37/T 4415 2021 5 5.5.4 转膜 SN/T 2497.16 2010 5.5.5 封闭 PVDF 2 h 4 5.5.6 第一抗 体结 合-PVDF 2 h 5.5.7 洗膜 TBST 10 min/3 5 5.5.8 第二抗 体结 合 PVDF 1 h 5.5.9 洗膜 TBST 10 min/3 5 5.5.10 显影 ECL A B 1 min 2 min 结果判 定与 表述 5.6 5.6.1 对照检 测结 果分 析-18 kD Western-Blot 5.6.2 样品检 测结 果判 定与 表述 SDS-PAGE-Western-Blot 18 kD-18 kD-6 酶联免 疫吸 附（ELISA）法-蛋白 定量 检测 原理 6.1-450 nm-DB 37/T 4415 2021 6 试剂或 材料 6.2 6.2.1 GB/T 6682 6.2.2 96 96 8 12 6.2.3 100-100 6.2.4 100-100 6.2.5 1 PBS 1.44 g 0.24 g 8 g 0.2 g 800 mL pH 7.4 1 L 6.2.6 1%BSA PBS 1 g BSA 100 mL PBS 6.2.7 0.05%20 PBS 50 L 20 100 mL PBS 6.2.8 TMB 6.2.9 2 M 10 mL 98%60 mL 100 mL 6.2.10-10 g/mL 5 g/mL 2.5 g/mL 1.25 g/mL 0.625 g/mL 0.313 g/mL 0.156 g/mL-0 g/mL 仪器设 备 6.3 6.3.1 12 000 r/min 24 2 mL 6.3.2 0.001 g 100 g 0.001 g 6.3.3 45 135 0.255 Mpa 6.3.4+5 80 6.3.5 450 nm 样品 6.4 5.4.1 5.4.2 1 000-试验步 骤 6.5 6.5.1 20 25 6.5.2 50 L 6.5.3 50 L 37 30 min 6.5.4 200 L 2 min 2 6.5.5 100 L-37 30 min 6.5.6 6.5.4 5 6.5.7 90 LTMB 37 20 min 6.5.8 50 L 450 nm 结果计 算 6.6 6.6.1 6.6.2 X-Y-DB 37/T 4415 2021 7 6.6.3-X=C N X-g/mL C-g/mL N 1 000 检出灵 敏度 6.7 ELISA 0.13 g/mL 7 检测过 程中 防止 交叉 污染 的措施 GB/T 27403 GB/T 19495.2 8 废弃物 的处 理 GB/T 19495.2 DB 37/T 4415 2021 8 A A 附录A（资料 性）PCR 扩 增的 野生 型牛-乳 球蛋白 基因 序列 gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGDB 37/T 4415 2021 9 CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGAAACCCCCCTCCTGCTGGAACTCACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGCCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGCCGGTGTCCTGGGGGCCTGTGGGTGACTGGGGACGGGGGCCAGACACACAGGCTGGGAGACGGGGGGCTGCAGCGCTCTGGTGTGACCATCACGATGGAGCCGGCGGTCACTATGAATCTAACAGCCTTTGTTACCGGGGAGTTTCAATTATTTCATCAAATAAGAACTCAGGCACAAAGCTGTCTTTCAACTGTCACGTCCTGAAAACAAATGGCAGGTGACATTTTCCATGCCATAGCAGTGCCACTGGGCATTTTCAGGGCCCATGTGCCAGGAGGGCGTGGGCATCGGCGAGTGGAGGCTCCTGGCCGTGTCAGCTGGCCCAGGGGGAGGAGGGGACCCAGACAGCCAGAGGTGGGGAGCAGGCTTTCCCCCTGTGACGCTGCAGACCCACCGCACTGCCCTGGGAGGAAGGGGAGGGAACTGGGCCAAGGGGGAAGGGCAGGTGTGCTGGAGGCCAAGGCAGACCTGCACACCACCCTGGAGAGCAGGGGTTGACCCCGTCCCGGCCCCACAGTCAGGACCCCGGAGGTGGACGACGAGGCCCTGGAGAAATTCGACAAAGCCCTCAAGGCCCTGCCCATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGCTGGAGGGTGAGCACCCAGGCCCCACCCTGCTCCTGGGGCAGGAAGCCACCCGGCCCAGGACCACCTCCTCCCATGGTGACCCCCAGCTCCCCAGGCCTCCCGGGAGGATGGAGACGGGGTGCAGGGCCCCGAGGTGGCCCCCTCCCCACCCCCTCCCCAGCTCCCTCTGTCCTGGGGTGTCCAGTCCCATCCTGACGCTCCCCCGCCACGGCTCTCCCTCCCCCACAGAGCAGTGCCACATCTAGGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGGGTTCTTGGTTGGGCCCGGGAGCCCCCATTAGGCCCTGGGGTCCCCCGTAGGAATGGCTGGAAGCTGGGGTCCTTCCTGGAGACTACAGAGCCGGCTGGCCACATGCTCGCTCTTGTGGGGTGACCTGTGTCCTGGCCTCACTCACACGCTGATCTCCTCCACCTCCTTCCTGGCAGACCTAAGGGCCAAGGTGGAGGGCTCAGGAAGTGACACCTAAGGGGGAGGCTAGGGGGGTCCTTCTCCCAAAGGAGGGGCCGTCCTGAATCCCCAGCCACGGACAGGCTGGCAAGGGTCTGGCAGGTACCCCAGGAATCACAGGGGAGCCCCATGTCCATTTCAGAGCCCGGGAGCCTTGGCCCCTCTGGGGACAGACGATGTCATCCCCGCCTGCCCCATCAGGGGACCAGGAGGAACCGGGACCACATTCACCCCTCCTGGGACCCAGGCCCCTCCAGGCCCCTCCTGGGGCCTCCTGCTTGGGGCCGCTCCTCCTTCAGCAATAAAGGCATAAACCTGTGCTCTCccttctgagtctttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatccagggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact 注：-ATG TAG DB 37/T 4415 2021 10 B B 附录B（资料 性）PCR 扩 增的16 bp 缺 失牛-乳 球蛋 白基 因序 列 gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGDB 37/T 4415 2021 11 CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCC