畜禽排泄物中喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法DB33／T 2482-2022.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 40 33 浙江省地方标准 DB33/T 2482 2022 畜禽排 泄 物中喹诺 酮类药物 残留量的 测定 液相色谱-串联质谱 法 Determination of quinolones residues in livestock and poultry excreta Liquid chromatography tandem mass spectrometry 2022-04-16 发布 2022-05-16 实施 浙江省市 场监督 管 理局 发 布 DB33/T 2482 2022 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本标 准的 某些 内容 可能涉 及专 利。本标 准的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本标准 由浙 江省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本标准 由浙 江省 畜牧 兽医 和饲料 标准 化技 术委 员会 归口。本标准 起草 单位：浙 江省 动物疫 病预 防控 制中 心、绿城农 科检 测技 术有 限公 司。本标准 主要 起草 人：裘丞 军、侯 轩、钟寒 辉、陈凯、王彬、陈 勇、孙冰 冰、蔡文金、何 晓明、倪 娟桢、吴 望君、任 玉琴。DB33/T 2482 2022 1 畜 禽排泄 物中 喹诺 酮 类药 物残留 量 的测定 液 相色谱-串 联质谱 法 1 范围 本标准 规定 了 畜 禽排 泄物 中氧氟 沙星、诺 氟沙 星、环丙沙 星、恩诺 沙星、洛 美沙星、奥 比沙 星、双氟沙星、沙 拉沙 星、恶喹 酸、依 诺沙 星、达氟 沙星、司帕 沙星、氟 甲喹、培 氟沙星、马 波沙 星 的 液 相 色谱-串 联质 谱测 定方 法。本标准 适用 于畜 禽排 泄物 中 上述15种 喹诺 酮类 药物 残留量 的测 定。本标准 的检 出限 为5 g/kg，定量 限为10 g/kg。注：畜禽排泄物包括畜禽排泄的粪便或粪便和尿液的混合物。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过规 范性文 件的 引用 而构 成本 标准必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本标 准；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本标准。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 25169 畜 禽监 测技 术规范 3 术语和 定义 本标准 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 原理 试样 中 残留的喹诺 酮类药物 用N,N-二甲基 甲酰胺和0.1 mol/L 盐酸溶 液提 取，用固 相萃取柱净化，液相色 谱-串联 质谱 仪测 定，基质 匹配 标准 曲线 校准，外标 法定 量。5 试剂或 材料 除非另 有规 定，均使 用分 析纯试 剂。5.1 水：GB/T 6682，一 级。5.2 甲 醇（CH3OH）：色 谱 纯。5.3 N,N-二 甲基 甲酰 胺（HCON(CH3)2）。5.4 0.1 mol/L 盐酸 溶液：量 取 9 mL 盐 酸，注入1 000 mL 水中，摇 匀。5.5 5%甲 醇溶 液：量取5 mL 甲 醇，加 水 至100 mL，摇匀。5.6 0.1%甲酸 溶液：量 取 1.0 mL 甲 酸，加水 至1 000 mL，摇匀。5.7 乙腈甲 酸溶 液：取 10 mL 乙腈，用0.1%甲酸 溶液 稀 释至 100 mL,混 匀。5.8 0.1%甲酸 甲醇 溶液：量 取1.0 mL 甲酸，加 甲醇（5.2）至 1 000 mL，摇匀。5.9 喹诺酮 类标 准品：各 标准 品信息 见附 录 A，纯 度均 95%。DB33/T 2482 2022 2 5.10 标准储 备溶 液（100 g/mL）：分 别称 取喹 诺酮 类标 准品（5.9）约10 mg（准 确至 0.01 mg），分别 置 100 mL 容量 瓶中，加 5 mLN,N-二 甲基 甲酰 胺（5.3）超 声使 溶解，用 甲 醇（5.2）稀释 至刻 度，混匀。-20 以下 避光 保存，有效 期 3 个月。5.11 混合标 准中 间工 作溶 液（1 g/mL）：分 别移 取标 准 储备溶 液（5.10）各 1.00 mL，置 100 mL 容量瓶中，用 甲醇（5.2）稀 释至刻 度，混匀。-20 以 下避 光保 存，有效 期 1 个月。5.12 混合系 列标 准工 作溶 液：准确移 取混 合标 准中 间工 作溶液（5.11）适量，用乙 腈甲酸 溶液（5.7）稀释成 浓度 为 2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 的 混合系 列标 准工 作溶 液，现配现 用。5.13 N-乙烯 吡咯 烷酮 和二 乙烯 基苯混 合固 相萃 取柱（HLB）：60 mg/3 mL，或 性能 相 当者。5.14 微孔滤 膜：0.22 m，水系。6 仪器设 备 6.1 液相色 谱 串联 质谱 仪：配有电 喷雾 离子 源。6.2 分析天 平：感 量0.01 mg、0.01 g。6.3 真空 冷 冻干 燥机：冷 阱温 度-50，真空 度10 Pa。6.4 离心机：转 速不 低 于10 000 r/min。6.5 氮吹仪。6.6 固相萃 取装 置。6.7 振荡 仪。6.8 涡旋混 合器。6.9 超声提 取仪。6.10 样品粉 碎设 备。6.11 分析筛：0.5 mm 孔径。7 样品制 备与 保存 按照GB/T 25169 采 集畜 禽 排泄物，用 四分 法缩 减至 约200 g，-40 以 下真 空 冷冻干 燥24 h，使 样品中的水 分在10%以下，粉碎，过0.5 mm 孔 径的分析筛（6.11），装入 密闭容器中，于-20 以下保存备用。取不含 待测 喹诺 酮类 药物 的样品 适量，按 上述 方法 制备，作为 空白 试样。8 测定步骤 8.1 提取 将装有 试样的密闭容器 取出，放 至室温。称取试样约2 g（精确至0.01 g），置于50 mL 离心管中，加N,N-二甲 基甲 酰胺（5.3）5.0 mL，涡 旋1 min，使 试 样完全 分散、浸 湿，再 加0.1 mol/L 盐 酸溶 液（5.4）5.0 mL，振 荡10 min，常温 水浴超 声10 min，10 000 r/min离心5 min，收集 上清 液 至另一50 mL 离心 管中；沉淀物 用5.0 mL N,N-二 甲 基甲酰 胺（5.3）和5.0 mL 0.1 mol/L 盐酸 溶液（5.4）重复 提取 一次，合 并上清液，混匀，10 000 r/min 离心5 min，移 取上 清液2.00 mL，用0.1 mol/L 盐酸 溶 液（5.4）稀 释至20 mL，混匀，备用。8.2 净化 DB33/T 2482 2022 3 取HLB 固相萃 取柱（5.13），依次 用甲醇3 mL、水3 mL 活化，取全部20 mL 稀释 备用 液（8.1）过柱，控制流 速在1.0 mL/min 以 下，依 次用 水3 mL，5%甲 醇溶液（5.5）3 mL 淋 洗，抽干，用甲 醇3 mL 洗脱，收集洗脱 液，35 水 浴中 氮 气吹干，加入 乙腈 甲酸 溶 液（5.7）1.00 mL，超声2 min、涡旋60 s 使残 余物 溶解，溶 液经 微孔 滤膜（5.14）过 滤，上 机 测定。8.3 基质匹 配混 合标 准曲 线的 制备 称取 空 白试 样约2 g（精 确 至0.01 g），按照8.1、8.2 步骤与 试样 同 法 操作，氮 气吹干 后分 别加 入1.00 mL混合 系列 标准 工作 溶液（5.12），溶 解后 经微 孔 滤膜（5.14）过滤，制 成2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL 的 基质 匹配 系列 标准 溶 液，用液相 色谱 串 联 质谱仪 测定。以特 征离 子质量色 谱峰 面积 为纵 坐标、标准 工作 液浓 度为 横坐 标，绘 制标 准曲 线，求回 归方程 和相 关系 数。8.4 液相色 谱-质谱 参考 条件 8.4.1 液相色 谱参 考条 件 色谱柱：C18 柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒度1.7 m，或性 能相 当者。柱温：35。进 样量：5 L。流动相：A：0.1%甲 酸溶 液（5.6）；B：0.1%甲 酸 甲醇溶 液（5.8），梯度 洗 脱程序 见表1。表1 梯度洗 脱程 序 时间 min 流速 mL/min A%B%0.0 0.3 95 5 2.0 0.3 85 15 5.0 0.3 60 40 7.0 0.3 5 95 7.1 0.3 95 5 11.0 0.3 95 5 8.4.2 质谱参 考条 件 离子化 模式：电 喷雾 离子 源（ESI），正 离子 多反 应 监测模 式（MRM）。喷雾电 压：1.0 kV。源温：150。雾化温 度：450。雾化气 流速：1 000 L/h。锥孔气 流速：30 L/h。碰撞气：氩 气。定性、定量 离子 对及 锥孔 电压和 碰撞 能量 参考 值见 表2。表2 定性、定量 离子 对及 锥孔 电压和 碰撞 能量 参考 条件 名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min 氟甲喹 262.1 244.1 262.1 244.1 56 16 6.26 262.1 108.1 56 30 DB33/T 2482 2022 4 表2（续）名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min 恶喹酸 262.1 244.0 262.1 244.1 56 17 5.38 262.1 216.0 56 27 诺氟沙星 320.2 302.1 320.2 302.1 56 18 3.75 320.2 276.2 56 16 依诺沙星 321.2 303.1 321.2 303.1 56 18 3.66 321.2 232.2 56 32 环丙沙星 332.2 314.1 332.2 314.1 56 19 3.89 332.2 288.1 56 16 培氟沙星 334.3 316.1 334.3 316.1 56 18 3.64 334.3 290.2 56 16 洛美沙星 352.2 265.1 352.2 265.1 56 21 4.12 352.2 308.1 56 16 达氟沙星 358.2 340.1 358.2 340.1 56 22 4.05 358.2 314.2 56 16 恩诺沙星 360.3 316.1 360.3 316.1 56 18 4.01 360.3 245.1 56 25 氧氟沙星 362.2 318.1 362.2 318.1 56 18 3.63 362.2 261.2 56 26 马波沙星 363.3 320.1 363.3 320.1 56 14 3.31 363.3 345.1 56 17 沙拉沙星 386.2 342.1 386.2 342.1 56 17 4.38 386.2 299.1 56 26 司帕沙星 393.3 349.2 393.3 349.2 56 18 4.85 393.3 292.1 56 23 奥比沙星 396.2 352.1 396.2 352.1 56 17 4.21 396.2 295.1 56 24 双氟沙星 400.2 356.1 400.2 356.1 56 18 4.23 400.2 299.1 56 28 8.5 定性测 定 在相同 试验 条件 下，试验 溶液（8.2）与 基质 匹配 系 列标准 溶液（8.3）中待 测 物的保 留时 间相 对偏差在2.5%之 内，且样品图谱中各 待测物定性离子的相对丰 度与浓度接近的基质匹配 系列标准溶液 中对应的 定性 离子 的相 对离 子丰度，若 偏差 不超 过表3 规定的 范围，则 可判 定为 样 品中存 在对 应的 待测 物。表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最大 允许 偏差 单位为百分号 相对离子丰度 允许的最大偏差 50 20 DB33/T 2482 2022 5 表3（续）单位为百分号 相对离子丰度 允许的最大偏差 2050（含）25 1020（含）30 10 50 8.6 定量测 定 以待测 药物 的浓 度为 横坐 标，色谱 峰面 积为 纵坐 标，绘制标 准曲 线，标 准曲 线 的相关 系数 应不 低于0.99。试 样溶 液与 标准 溶 液中待 测物 的响 应值 均应 在仪器 检测 的线 性范 围内，如 超出 线性 范围，应重 新试验或 将试 样溶 液作 相应 稀释后 重新 测定。15 种喹 诺 酮类药 物基 质匹 配标 准溶 液的特 征离 子色 谱图 见 附录B。9 试验数 据处 理 试样中 喹诺 酮类 药物 的残 留量 以 质量 分数 计，数 值以 微 克每 千克（g/kg）表示。按 式计 算：10001000=21 V mV V C(1)式中：试 样中 喹诺 酮 类 药物 的 残留 量，单位 为 微 克每 千克（g/kg）；C 从 基质 匹配 标准 曲线 查得的 试样 溶液 中待 测物 的浓度，单 位为 纳克 每毫 升（ng/mL）；V 试 样提 取液 总体 积，单位为 毫升（mL）；1V 试 样净 化后 溶解 残余 物的体 积，单位 为毫 升（mL）；m 试 样质 量，单位 为克（g）；2V 移 取的 提取 液体 积，单位为 毫升（mL）。测定结 果用 两次 平行 测定 的算术 平均 值表 示，结果 保留三 位有 效数 字。10 检测方 法准 确度 和精 密度 10.1 准确度 本 方法 在10.0 g/kg、20.0 g/kg、500 g/kg 三 个添 加 浓度 水平 的回 收率 为60%120%。10.2 精密度 在重复 性条 件下，两 次独 立测定 结果 与其 算术 平均 值的绝 对差 值不 大于 该算 术平均 值的20%。DB33/T 2482 2022 6 A A 附录A（资料 性）15 种 喹诺 酮 类 标准 物质 中 文英文 名称 对照、分 子式、相对 分子 质量 和 CAS 号 15种喹 诺酮 类标 准物 质中 文英文 名称 对照、分 子式、相 对 分子 质量 和CAS号见表A.1。表A.1 15 种 喹诺 酮 类 标准 物质 中文英 文名 称对 照、分子 式、相 对分 子质 量 和 CAS 号 序号 中文名称 英文名称 分子式 相对分子质量 CAS 号 1 氟甲喹 Flumequine C14H12FNO3 214.24 144-80-9 2 恶喹酸 Oxolinic Acid C13H11NO5 249.29 144-83-2 3 诺氟沙星 Norfloxacin C16H18FN3O3 250.28 68-35-9 4 依诺沙星 Enoxacin C15H17FN4O3 253.28 723-46-6 5 环丙沙星 Ciprofloxacin C17H18FN3O3 255.32 72-14-0 6 培氟沙星 Pefloxacin C17H20FN3O3 264.30 127-79-7 7 洛美沙星 Lomefloxacin C17H19F2N3O3 267.30 729-99-7 8 达氟沙星 Danofloxacin C19H20FN3O3 267.30 127-69-5 9 恩诺沙星 Enrofloxacin C19H22FN3O3 270.33 144-82-1 10 氧氟沙星 Ofloxacin C18H20FN3O4 276.31 127-71-9 11 马波沙星 Marbofloxacin C17H19FN4O4 278.33 57-68-1 12 沙拉沙星 Sarafloxacin C20H17F2N3O3 278.33 515-64-0 13 司帕沙星 Sparfloxacin C19H22F2N4O3 280.31 651-06-9 14 奥比沙星 Orbifloxacin C19H20F3N3O3 280.30 80-35-3 15 双氟沙星 Difloxacin C21H19F2N3O3 280.30 1220-83-3 DB33/T 2482 2022 7 B B 附录B（资料 性）15 种 喹诺 酮 类 药物 标 准 溶 液特征 离子 质量 色谱 图 15 种喹 诺酮 类药 物基 质匹 配标准 溶液 特征 离子 质量 色谱图 见 图B.1。DB33/T 2482 2022 8 标引序号说明：1 氟甲喹；2 恶喹酸；3 诺氟沙星；4 依诺沙星；5 环丙沙星；6 培氟沙星；7 洛美沙星；8 达氟沙星；9 恩诺沙星；10 氧氟沙星；11 马波沙星；12 沙拉沙星；13 司帕沙星；14 奥比沙星；15 双氟沙星。图B.1 15 种 喹诺 酮 类 药物 基质 匹 配标准 溶液（20 ng/mL）特征 离子 质量 色谱 图