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ICS 65.020.20 CCS B 05 DB23 黑龙江省地方标准 DB23/T 3169 2022 大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价 技术规程 2022-05-09 发布 2022-06-08 实施 黑龙江省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB23/T 31692022 I 前 言 本文件 依 据 GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由黑 龙江 省农 业农 村厅提 出。本文件 起草 单位：黑 龙江 省农业 科学 院土 壤肥 料与 环境资 源研 究所。本标准 主要 起草 人：王爽、孙磊、金 品娇、李 伟群、陈雪 丽、万书 明、刘凯、李一 丹、孙秀 君。DB23/T 31692022 1 大豆 根瘤 菌竞争结 瘤能力 与固氮效 果评价 技术规程 1 范围 本 文件 规定 了大 豆根 瘤菌 竞争结 瘤能 力与 固氮 效果 评价技 术 的 术语 和定 义、结 瘤能力 评价 与固 氮 效果评 价 的方法。本 文件 适用 于 外 源接 种大 豆根瘤 菌的 效果 评价。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 19495.2 转基 因产 品检测 实 验室 技术 要求 GB/T 19495.3-2004 转 基 因产品 检测 核 酸提 取纯 化方法 NY/T 2066-2011 微 生物 肥料生 产菌 株的 鉴别 聚 合酶链 式反 应（PCR）法 3 术 语 和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 占 瘤率 应用特 定根 瘤菌 株接 种豆 科植物 与土 著根 瘤菌 竞争 结瘤,在竞 争中 特定 根瘤 菌 结瘤数 占总 瘤数 的百分数称 为占 瘤率。占 瘤率 是评估 接种 根瘤 菌相 对土 著根瘤 菌的 竞争 结瘤 能力 的重要 参数。3.2 竞争结 瘤能 力 根瘤菌 能够 在宿 主豆 科植 物上形 成根 瘤，而且 它在 其他根 瘤 菌 存在 的情 况下，也能 与相 同的 豆科 植物结瘤 的能 力，叫做 竞争 结瘤能 力。3.3 固氮能力 固氮能 力是 根瘤 菌将 分子 态氮还 原成 氨和 其他 含氮 化合物 的能 力，通过 对比 接 种待测 菌株 与未 接 种处理的 根瘤 固氮 酶活 性和 植株全 氮含 量来 评价。4 结瘤 能力 评价 4.1 一般 要求 实 验室 操作 人员 应具 备良好 的分 子生 物学 专业 技能，操作 熟练。有 毒、有 害、废 弃物 的处 理及 安 全防护应 符合GB/T 19495.2 的要求。DB23/T 31692022 2 4.2 原理 利用BOX-PCR 指纹 图谱 比 较，检测 接种 根 瘤菌 菌株的 占瘤率，以此 评价 供试菌 株 相对 于土著 根瘤 菌的竞争 结瘤 能力；根据 根瘤 固氮 酶活性 和 大豆 植株 全氮含 量，协同 评价 根瘤 菌的固 氮能 力。4.3 主要 材料 与用具 铁 锹、小铲、镊子、记号笔、塑 料袋、剪 刀、冰盒、小 型 离心 机、微 量 可调移 液 器 及对 应 的无 菌Tip 头、1.5 mL 无 菌离 心 管、振荡 培养 箱（摇床）、静 置培 养箱、高 压蒸汽灭菌锅、分光 光度 计、细菌基因 组DNA 提取 试剂 盒、超净工 作台、PCR 仪、电 泳仪及 电泳 槽、凝胶 成像 分析仪 等。4.4 占瘤 率测 定方 法 4.4.1 蛭 石盆 栽实 验中 根 瘤菌占 瘤率 的测 定 根瘤菌 占瘤 率的 测定 按照 如下程 序进 行：a）大 豆种 子的 处理 精选无 病、饱满、大 小一 致的大 豆种 子，经过75%酒 精处理2 min、20%次 氯酸 钠处理5 min、无菌 水水洗3 次后 置于1%水琼 脂培养 基 上培 养，待 其萌 芽后种 植 于灭 菌 的蛭 石中，进行 蛭 石盆 栽 培养，每盆3粒4 粒大 豆种 子。b）根 瘤菌 接种 将根瘤 菌接种于YMA 培养 基（配方 见附录A）上，5 d 后用生 理盐水 将菌 体洗下 来。待 大豆 对 生真 叶展开时，将 上述 菌悬 液接 种于根 部，每盆 约5 mL 菌液（OD600=1.0），每 个菌 株接种3棵4棵 植株。以 不接种无 菌生 理盐 水 的 大豆 为阴性 对照。c）根 瘤中 收获 类菌 体 蛭石盆栽 培养45 d 后收获 根瘤，每个盆 中 随 机挑取3 个5个 根瘤，分别 用75%乙醇消 毒1 min、15%次氯酸 钠消 毒3 min、无 菌 水水洗3次 后置 于灭 菌的EP 管中，用 灭菌的 镊子 将根 瘤捣碎 后，使根 瘤内 汁液流出，去除 植物 根瘤 组织 后，加 入10 L 的无 菌水，13000 rpm 离心3 min，保 留沉淀，即 为收 获的 类 菌体。d）类 菌体DNA 的制 备 在上述 收获的 类菌 体中加 入10 L无菌 水充 分悬浮 类菌体，混匀 后于 沸水中 煮沸5 min，然后迅 速移入冰 上冰 浴5 min，随后 进行13000 rpm离心3 min，取上清 液，参照 细菌 基因 组DNA 提取 试剂 盒说 明书提取根 瘤菌 基因 组DNA，即 为类菌 体DNA 模 板。e）BOX-PCR扩增 以接种 菌株 的基 因组DNA 为 对照进 行BOX-PCR，接种 菌 株的DNA 提 取方 法按照GB/T 19495.3-2004 附录A.4中 的规 定执 行，BOX-PCR 扩增 体系 及扩 增反 应程 序 见附录B。f）BOX-PCR 产物 的检 测：电泳结 束后 在 凝 胶成 像分析 仪中 扫描 凝胶，将指 纹 图谱用TIFF 文件 保存，PCR产 物电 泳图 谱带 型按 照NY/T 2066-2011 中5.6 和6.2 规定 的方 法进 行检 测与 判 定。4.4.2 土 壤盆 栽试 验中 根 瘤菌占 瘤率 的测 定 以土壤 作为 大豆 生产 的基 质，按 照上 述方 法进 行土 壤盆栽 试验，从 根际 随机 挑取20 个根 瘤并 进行 根瘤表面 消毒，无 菌水 清洗 后，按 照上 述方 法进 行BOX-PCR 扩 增及 图谱 分析。4.4.3 结 果分 析 对比 分 离 根 瘤 菌与 接 种 菌种 的BOX-PCR 指 纹 图谱，达到100%相 似水 平 时 即 可定位 同 一 类BOX图谱类型，统 计 各 类型 的菌 株数量，占空 白对 照所 分离 的根 瘤 菌菌株 的比 例即 为 属 于该 类型的 根瘤 菌的 占瘤 率。DB23/T 31692022 3 5 固 氮效 果评 价 5.1 材料 与工 具 大豆 盛 花期 植株 根瘤 样品，102G 型气 相色 谱仪，标 准乙烯（灵 敏度 为103，衰 减1/128），待测 样品中乙烯（灵敏 度为104，衰 减1/1），乙炔（C2H2）气体，100 mL 带有 异丁 基胶 塞的 血清瓶，注射 器（1 mL、10 mL 密封 性能 好的），100 L 微量 注射 器。5.2 固氮 酶活 性测 定 采用乙 炔还 原法 测定 大豆 根瘤菌 固氮 酶活 性：取样 计数后 将鲜 根瘤 称重，收 集到100 mL 血清 瓶中，立即用 异丁基 胶塞 密封，然后按 瓶子中 气相 体积用 注射器 从瓶中 抽空5%10%的空气，再用 注射 器注 入等体积的C2H2，28 C保温2 h。取出瓶子，用注射器吸出100 mL的混合气体，用气相色谱仪以外标法测定其固 氮酶 活性。计 算公 式如下：t mnU 式中：U 根瘤 固氮 酶活 性 nmol/mg/h；n 乙烯 含量 nmol；m 根瘤 鲜重 mg；t 反应 时间 h。5.3 全 氮含 量测 定 植物 全 氮含 量 计 算公 式如 下：1000014.0 1 2 V V mV V cW3 式中：W 植株 全氮 含量 g/kg；c 硫酸 标准 溶液 的浓 度 0.01 moL/L；V1 空白 滴定 消耗 标准 液量 mL；V2 试剂 滴定 消耗 标准 液量 mL；V3 上机 测试 液量10 mL；m 样品 质量 g；V 消煮 后定 容液 量100 mL；0.014 氮的 毫摩 尔质 量 g/mmoL。DB23/T 31692022 4 附录A（规范 性）培养基 配方 A.1 YMA 培养 基配 方 甘露醇，10.0 g；酵母粉，0.8 g；K2HPO4，0.25 g；KH2PO4，0.25 g；MgSO4 7H2O，0.2 g；NaCl，0.1 g；0.25%溴 麝香 草酚 蓝（仅 在从 根瘤 中分 离根 瘤菌时 选择 性的 加入），1 mL；琼脂，15 g18 g；蒸馏水，1000 mL；pH 值，6.8 7.0。DB23/T 31692022 5 附录B（规范 性）BOX-PCR 扩 增体 系及 扩增 反应程 序 B.1 BOX-PCR 引物 BOX-A1R：5-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3。B.2 扩增 体系 为25.0 L 10 Reaction Buffer，2.5 L；MgCl2（20 mmol L-1），5.6 L；BSA（10 mg mL-1），0.2 L；4 dNTP（10 mmol L-1），2.0 L；100%DMSO，2.5 L；BOX Primer（30 mol L-1），0.32 L；模板DNA（100 ng L-1），1.0 L；Tag DNA 聚合 酶（5 U L-1），1.0 L；ddH2O补 足至25.0 L。B.3 BOX-PCR 扩 增程 序 95 C 预 变性2 min，94 C 变性1 min，52 C退火1 min，65 C延伸8 min30 个 循环，65 C 最终 延伸18 min，PCR 产物40 C 暂存5 min。
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