畜禽排泄物中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法DB33／T 2481-2022.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 40 33 浙江省地方标准 DB33/T 2481 2022 畜禽排 泄 物中磺胺 类药物残 留量的测 定 液相色谱-串联质谱 法 Determination of sulfonamides residues in livestock and poultry excreta Liquid chromatography tandem mass spectrometry 2022-04-16 发布 2022-05-16 实施 浙江省市 场监督 管 理局 发 布 DB33/T 2481 2022 I 前 言 本标准 按 照GB/T 1.1 2020 标 准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本标 准的 某些 内容 可能涉 及专 利。本标 准的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本标准 由浙 江省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本标准 由浙 江省 畜牧 兽医 和饲料 标准 化技 术委 员会 归口。本标准 起草 单位：浙 江省 动物疫 病预 防控 制中 心、绿城农 科检 测技 术有 限公 司。本标准 主要起 草人：黄娟、裘丞 军、王 彬、罗成江、陈洁、侯轩、陈 晓林、阮鑫、周蕾、赵月 均、任玉琴。DB33/T 2481 2022 1 畜 禽排泄 物中磺胺 类药物 残留 量的 测定 液 相色谱-串 联质谱 法 1 范围 本标准 规定 了畜 禽排 泄物 中磺胺 醋酰、磺 胺吡 啶、磺胺嘧 啶、磺胺 甲噁 唑、磺胺噻 唑、磺胺 甲 基 嘧啶、磺 胺二 甲噁 唑、磺 胺 异噁唑、磺 胺甲 噻二 唑、苯甲酰 磺胺、磺 胺二 甲嘧 啶、磺 胺异 嘧啶、磺胺 对 甲氧嘧啶、磺 胺甲 氧哒 嗪、磺胺间 甲氧 嘧啶、磺 胺氯 哒嗪、磺胺 喹噁 啉、磺 胺 邻二甲 氧嘧 啶、磺胺 间二 甲氧嘧啶、磺 胺苯 吡唑 的液 相色谱-串 联质 谱测 定方 法。本标准 适用 于畜 禽排 泄物 中上述20种 磺胺 类药 物残 留量的 测定。本标准 的检 出限 为2 g/kg，定量 限为5 g/kg。注：畜禽排泄物包括畜禽排泄的粪便或粪便和尿液的混合物。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过规 范性文 件的 引用 而构 成本 标准必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本标 准；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本标准。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 25169 畜 禽监 测技 术规范 3 术语和 定义 本标准 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 原理 试样中 残留的 磺胺 类药物 经酸化 乙腈溶 液提 取，氮 气吹干 后用 磷 酸盐 溶液复溶，固 相萃取 柱净化，液相色 谱-串联 质谱 仪测定，基质 匹配 标准 曲线 校准，外标 法 定 量。5 试剂或 材料 除非另 有规 定，均使 用分 析纯试 剂。5.1 水：GB/T 6682，一 级。5.2 甲醇（CH3OH）：色 谱纯。5.3 正己烷（C6H14）。5.4 90%酸 化乙 腈溶 液：取 900 mL 乙 腈，加冰 乙酸10 mL，加水 稀释 至1 000 mL，混匀。5.5 0.05 mol/L 磷酸 盐溶 液：取 1.48 g 磷 酸二 氢钠 和 14.50 g 磷 酸氢 二钠，加 水溶 解稀释 至 1 000 mL,混匀。5.6 5%甲 醇溶 液：取50 mL 甲 醇，加 水稀 释 至1 000 mL，混匀。5.7 5%氨 化甲 醇：取5 mL 氨 水，加甲 醇稀 释 至100 mL，混匀。DB33/T 2481 2022 2 5.8 0.1%甲酸 溶液：取1.0 mL 甲酸，加水 稀释 至1 000 mL，混 匀。5.9 乙腈甲 酸溶 液：取 10 mL 乙腈，用0.1%甲酸 溶液 稀 释至 100 mL，混 匀。5.10 0.1%甲 酸甲 醇溶 液：取 1.0 mL 甲 酸，加甲 醇稀 释 至1 000 mL，混匀。5.11 磺胺类 标准 品：各标 准品 信息见 附 录 A，纯度 95%。5.12 标准贮 备溶 液(1 mg/mL)：分别称取 磺 胺类 标准 品（5.11)约10 mg（准 确至0.01 mg），分别 置10 mL 棕 色容 量瓶 中，用甲 醇（5.2）溶 解并 定容 至刻 度，混匀。-20 以下 保存，有效 期 6 个月。5.13 混合标 准中 间溶 液(10 g/mL)：分别 吸 取标 准贮 备 溶液（5.12）各 1.00 mL，置于 100 mL 棕色容量瓶 中，用甲 醇（5.2）稀释至 刻度，混 匀，-20 以下 保存，有 效 期1 个 月。5.14 混合标 准中 间溶 液(250 ng/mL)：准 确吸 取混 合标 准 中间溶 液（5.13）250 L，置 于10 mL 棕色容量 瓶中，用 乙腈 甲酸 溶液（5.9）稀 释至 刻度，混匀，现用 现配。5.15 系列混 合标准 工作 溶液：准确吸 取混合 标准 中间溶 液（5.14）适量，用乙 腈甲酸 溶液（5.9）稀释成 浓度 为 2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、250.0 ng/mL 的系 列标 准工作溶 液，现用 现配。5.16 N-乙烯 吡咯 烷酮 和二 乙烯 基苯混 合固 相萃 取柱（HLB）：60 mg/3 mL 或性 能相 当者。5.17 微孔滤 膜：0.22 m，水 系。6 仪器设 备 6.1 液相色 谱 串联 质谱 仪：配有电 喷雾 离子 源。6.2 分析天 平：感 量0.01 mg、0.01 g。6.3 真空 冷 冻干 燥机：冷 阱温 度-50，真空 度10 Pa。6.4 离心机：转 速不 低 于10 000 r/min。6.5 氮吹仪。6.6 固相萃 取装 置。6.7 振荡 仪。6.8 涡旋混 合器。6.9 超声提 取仪。6.10 样品粉 碎设 备。6.11 分析筛：0.5 mm 孔径。7 样品制 备与 保存 按照GB/T 25169 采 集畜 禽 排泄物，用 四分 法缩 减至 约200 g，-40 以 下真 空 冷冻干 燥24 h，使 样品中的水 分在10%以下，粉碎，过0.5 mm 孔 径的分析筛（6.11），装入 密闭容器中，于-20 以下保存备用。取不含 待测 磺胺 类药 物的 样品适 量，按上 述方 法制 备，作 为空 白试 样。8 测定步骤 8.1 试样 溶 液制 备 8.1.1 提取 DB33/T 2481 2022 3 将装有 试样的密闭容器取出，放 至室温。称取试样约2 g（精确到0.01 g），置于50 mL 离心管中，准确加 入90%酸 化乙 腈溶 液（5.4）10.0 mL，涡 旋使 试 样分散，振 荡10 min，超 声 提取10 min，10 000 r/min离心5 min。准确移取上 清液2 mL，置于10 mL 试管 中，加入0.05 mol/L 磷酸盐溶液（5.5）1 mL，混匀，于30 水 浴中 氮气 吹至 残 余物小 于1 mL。再 加入0.05 mol/L 磷酸 盐溶 液（5.5）3 mL、正 己烷（5.3）2 mL，涡旋1 min、超 声2 min，使 残余物 溶解，静 置分 层或10 000 r/min 离心2 min，取 下层水 相备 用。8.1.2 净化 取HLB固 相萃 取柱（5.16），依次 用甲醇5 mL和水5 mL活化，取全部 备用 液（8.1.1）过 柱，控 制流速在1.0 mL/min 以 下，依 次用水3 mL，5%甲 醇溶液（5.6）3 mL 淋洗，抽干。用5%氨 化甲醇（5.7）3 mL洗脱，收集 洗脱 液，30 水浴中 氮气 吹干，加 乙腈 甲酸溶 液（5.9）1.00 mL，超声2 min、涡旋60 s 使残余物溶 解，溶液 经0.22 m 微孔滤 膜（5.17）过 滤，上机测 定。8.2 基质匹 配混 合标 准曲 线的 制备 称取空 白试 样 约2 g（精 确 至0.01 g），按8.1 步骤 操 作，氮 气吹 干后 分别 准确 加入系 列混 合标 准工作溶液（5.15）1.00 mL，混 合溶解 后经 微孔 滤膜（5.17）过 滤，制成2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、250.0 ng/mL 的基 质匹 配 系列标 准溶 液，用液 相色 谱 串 联质 谱 仪 测定。以特征离 子质 量色 谱峰 面积 为纵坐 标、标 准工 作溶 液 浓度为 横坐 标，绘 制基 质 匹 配标 准曲 线，求 回归 方 程和相关 系数。8.3 液相色 谱-质谱 参考 条件 8.3.1 液相色 谱参 考条 件 色谱柱：C18 柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒度1.7 m，或性 能相 当者。柱温：35。进 样量：5 L。流动相：A：0.1%甲 酸溶 液（5.8）；B：0.1%甲 酸 甲醇溶 液（5.10），梯度 洗脱程 序见 表1。表1 梯度洗 脱程 序 时间 min 流速 mL/min A%B%0.0 0.3 95 5 2.0 0.3 85 15 5.0 0.3 60 40 7.0 0.3 5 95 7.1 0.3 95 5 11.0 0.3 95 5 8.3.2 质谱参 考条 件 离子化 模式：电 喷雾 离子 源（ESI），正 离子 多反 应 监测模 式（MRM）。喷雾电 压：1.0 kV。源温：150。雾化温 度：450。雾化气 流速：1 000 L/h。锥孔气 流速：30 L/h。DB33/T 2481 2022 4 碰撞气：氩 气。定性、定量 离子 对及 锥孔 电压和 碰撞 能量 参考 值见 表2。表2 定性、定量 离子 对及 锥孔 电压和 碰撞 能量 参考 条件 名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min 磺胺醋酰 215.1 156.1 215.1 156.1 20 10 1.39 215.1 108.1 20 18 磺胺吡啶 250.2 156.1 250.2 156.1 20 16 2.40 250.2 108.1 20 25 磺胺嘧啶 251.2 156.1 251.2 156.1 20 14 1.86 251.2 108.1 20 24 磺胺甲噁 唑 254.1 156.1 254.1 156.1 20 15 3.90 254.1 108.1 20 25 磺胺噻唑 256.3 156.1 256.3 156.1 20 14 2.24 256.3 108.1 20 22 磺胺甲基嘧啶 265.2 156.1 265.2 156.1 20 16 2.61 265.2 172.1 20 14 磺胺二甲 噁 唑 268.2 156.1 268.2 156.1 20 15 3.35 268.2 113.1 20 20 磺胺异噁 唑 268.2 156.1 268.2 156.1 20 13 4.24 268.2 113.1 20 16 磺胺甲噻二唑 271.2 156.1 271.2 156.1 20 13 3.31 271.2 108.1 20 20 苯甲酰磺胺 277.1 156.1 277.1 156.1 20 10 4.47 277.1 108.1 20 23 磺胺二甲嘧啶 279.2 186.1 279.2 186.1 20 16 3.32 279.2 124.1 20 24 磺胺异嘧啶 279.2 124.2 279.2 124.2 20 20 2.01 279.2 186.1 20 15 磺胺对甲氧嘧啶 281.2 156.1 281.2 156.1 20 17 3.17 281.2 126.2 20 17 磺胺甲氧哒嗪 281.2 156.1 281.2 156.1 20 17 3.54 281.2 126.2 20 17 磺胺间甲氧嘧啶 281.2 156.1 281.2 156.1 20 16 3.94 281.2 126.2 20 18 磺胺氯哒嗪 285.2 156.1 285.2 156.1 20 13 3.73 285.2 108.1 20 25 磺胺喹噁 啉 301.1 156.1 301.1 156.1 20 16 5.40 301.1 108.1 20 26 磺胺邻二甲氧嘧啶 311.1 156.1 311.1 156.1 20 20 4.16 311.1 108.1 20 30 DB33/T 2481 2022 5 表2（续）名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 保留时间 min 磺胺间二甲氧嘧啶 311.1 156.1 311.1 156.1 20 17 5.18 311.1 91.8 20 30 磺胺苯吡唑 315.2 158.2 315.2 158.2 20 30 4.83 315.2 160.2 20 22 8.4 定性测 定 在相同 试验 条件 下，试样 溶液（8.1.2）与基 质匹 配 系列标 准溶 液（8.2）中 待 测物的 保留 时间 相对偏差在 2.5%之内，且样品图谱中 各待测物定性离子的相对 丰度与浓度接近的基质匹 配系列标准溶 液中对应 的定性 离子 的相对 离子丰 度，若 偏差 不超过 表3 规定 的范 围，则 可判 定 为样 品 中存在 对应 的待 测物。表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最大 允许 偏差 单位为百分号 相对离子丰度 允许的最大偏差 50 20 2050（含）25 1020（含）30 10 50 8.5 定量测 定 以待测 药物 的浓 度为 横坐 标，色谱 峰面 积为 纵坐 标，绘制标 准曲 线，标 准曲 线 的相关 系数 应不 低于0.99。试 样溶 液与 标准 溶 液中待 测物 的响 应值 均应 在仪器 检测 的线 性范 围内，如 超出 线性 范围，应重 新试验或 将试 样溶 液作 相应 稀释后 重新 测定。20 种磺 胺 类药物 基质 匹配 标准 溶液 的特征 离子 色谱 图见 附 录B。9 试验数 据处 理 试样中 磺胺 类药 物的 残留 量 以质 量分 数 计，数 值以 微 克每 千克（g/kg）表示。按 式计 算：10001000=21 V mV V C(1)式中：试 样中 磺胺 类药 物的 残留量，单 位为 微克 每千 克（g/kg）；C 从 基质 匹配 标准 曲线 查得的 试样 溶液 中待 测物 的浓度，单 位为 纳克 每毫 升（ng/mL）；V 试 样提 取液 总体 积，单位为 毫升（mL）；1V 试 样净 化后 溶解 残余 物的体 积，单位 为毫 升（mL）；m 试 样质 量，单位 为克（g）；DB33/T 2481 2022 6 2V 移 取的 提取 液体 积，单位为 毫升（mL）。测定结 果用 两次 平行 测定 的算术 平均 值表 示，结果 保留三 位有 效数 字。10 检测方 法准 确度 和精 密度 10.1 准确度 本方法 在5.0 g/kg、10.0 g/kg、500 g/kg 三个 添 加 浓度 水平 的回 收率 为60%120%。10.2 精密度 在重复 性条 件下，两 次独 立测定 结果 与其 算术 平均 值的绝 对差 值不 大于 该算 术平均 值的20%。DB33/T 2481 2022 7 A A 附录A（资料 性）20 种 磺胺 类标 准物 质中 文 英文名 称对 照、分子 式、相对分 子质 量 和 CAS 号 20 种磺 胺类 标准 物质 中文 英文名 称对 照、分子 式、相 对分 子质 量和CAS 号见 表A.1。表A.1 20 种 磺胺 类标 准物 质中 文英文 名称 对照、分 子式、相对 分子 质量 和 CAS 号 序号 中文名称 英文名称 分子式 相对分子质量 CAS 号 1 磺胺醋酰 Sulfacetamide C8H10N2SO3 214.24 144-80-9 2 磺胺吡啶 Sulfapyridine C11H11N3O2S 249.29 144-83-2 3 磺胺嘧啶 Sulfadiazine C10H10N4O2S 250.28 68-35-9 4 磺胺甲噁 唑 Sulfamethoxazole C10H11N3O3S 253.28 723-46-6 5 磺胺噻唑 Sulfathiazole C9H9N3O2S2 255.32 72-14-0 6 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine C11H12N4O2S 264.30 127-79-7 7 磺胺二甲 噁唑 Sulfamoxole C11H13N3O3S 267.30 729-99-7 8 磺胺异噁 唑 Sulfisoxazole C11H13N3O3S 267.30 127-69-5 9 磺胺甲噻二唑 Sulfamethizole C9H10N4O2S2 270.33 144-82-1 10 苯甲酰磺胺 Sulfabenzamide C13H12N2O3S 276.31 127-71-9 11 磺胺二甲嘧啶 Sulfamethazine C12H14N4O2S 278.33 57-68-1 12 磺胺异嘧啶 Sulfisomidine C12H14N4O2S 278.33 515-64-0 13 磺胺对甲氧嘧啶 Sulfameter C11H12N4O3S 280.31 651-06-9 14 磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine C11H12N4O3S 280.30 80-35-3 15 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine C11H12N4O3S 280.30 1220-83-3 16 磺胺氯哒嗪 Sulfachloropyridazine C10H9ClN4O2S 284.72 80-32-0 17 磺胺喹噁 啉 Sulfaquinoxaline C14H12N4O2S 300.34 59-40-5 18 磺胺邻二甲氧嘧啶 Sulphadoxine C12H14N4O4S 310.33 2447-57-6 19 磺胺间二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine C12H14N4O4S 310.33 155-91-9 20 磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole C15H14N4O2S 314.37 526-28-9 DB33/T 2481 2022 8 B B 附录B（资料 性）20 种 磺胺 类药 物标 准溶 液 特征离 子质量 色 谱图 20种磺 胺类 药物 基质 匹配 标准 溶 液特 征离 子质量 色 谱图见 图B.1。DB33/T 2481 2022 9 标引序号说明：1 磺胺醋酰；2 磺胺吡啶；3 磺胺嘧啶；4 磺胺甲噁唑；5 磺胺噻唑；6 磺胺甲基嘧啶；7 磺胺二甲噁唑；8 磺胺异噁唑；9 磺胺甲噻二唑；10 苯甲酰磺胺；11 磺胺二甲嘧啶；12 磺胺异嘧啶；13 磺胺对甲氧嘧啶；14 磺胺甲氧哒嗪；15 磺胺间甲氧嘧啶；16 磺胺氯哒嗪；17 磺胺喹噁啉；18 磺胺邻二甲氧嘧啶；19 磺胺间二甲氧嘧啶；20 磺胺苯吡啶。图B.1 20 种 磺胺 类药 物基 质匹 配标准 溶液（50 ng/mL）特 征离 子质量 色谱 图