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I C S 1 1.2 2 0C C S B 4 0黑 龙 江 省 地 方 标 准D B 2 3/T 3 0 3 2 2 0 2 12 0 2 1-1 2-2 4 发 布黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局发 布2 0 2 2-0 1-2 3 实 施DB23规 模 化 奶 牛 场 牛 白 血 病 净 化 技 术 规 程D B 2 3/T 3 0 3 8 2 0 2 1前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规定 起 草。本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 局 归 口。本 文 件 起 草 单 位：黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学，东 北 农 业 大 学。本 文 件 主 要 起 草 人：王 建 发、刘 云、武 瑞、连 帅、贺 显 晶、王 爽、宋 军、孙 东 波、周 玉 龙、王 海、胡 学 权、谢 颖 颖。D B 2 3/T 3 0 3 8 2 0 2 11规 模 化 奶 牛 场 牛 白 血 病 净 化 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 开 展 牛 白 血 病 净 化 的 技 术 规 程。本 文 件 适 用 于 规 模 化 奶 牛 场 实 施 针 对 牛 白 血 病 的 净 化。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，标 注 日 期 的 引 用文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 标 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B 1 6 5 6 8 奶 牛 场 卫 生 规 范N Y/T 5 7 4-2 0 0 2 地 方 流 行 性 牛 白 血 病 琼 脂 凝 胶 免 疫 扩 散 试 验 方 法中 国 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心 规 模 化 奶 牛 场 主 要 动 物 疫 病 净 化 技 术 指 南3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1牛 白 血 病牛 白 血 病 是 由 牛 白 血 病 病 毒 引 起 的 一 种 以 淋 巴 细 胞 恶 性 增 生，进 行 性 恶 病 质 变 化 和 全 身 淋 巴 结 肿大 为 特 征 的 一 种 慢 性、进 行 性、接 触 传 染 性、肿 瘤 性 疾 病。3.2动 物 疫 病 净 化在 一 个 养 殖 场 或 指 定 区 域 内，通 过 持 续 监 测 和 检 测 发 现 患 病 动 物 或 带 毒 动 物，并 通 过 淘 汰 带 毒 动物 以 实 现 根 除 某 种 动 物 疫 病 的 过 程。4 检 测 规 程4.1 琼 脂 凝 胶 免 疫 扩 散 试 验使 用 一 次 性 无 菌 采 血 设 备 采 集 待 检 牛 只 血 液，分 离 血 清。按 照 N Y/T 5 7 4-2 0 0 2 检 测 血 清 中 牛 白 血 病病 毒 g p 5 1 抗 原，检 测 结 果 阳 性 即 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性。4.2 酶 联 免 疫 吸 附 试 验无 菌 采 集 待 检 牛 只 血 液，分 离 血 清 或 血 浆。使 用 符 合 要 求 的 商 品 化 试 剂 盒 按 说 明 检 测 血 清 或 血 浆中 牛 白 血 病 病 毒 g p 5 1 抗 原 或 牛 白 血 病 病 毒 X 2 抗 体，检 测 结 果 阳 性 即 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性。无 菌 采 集 待 检 泌 乳 牛 乳 汁，使 用 符 合 要 求 的 商 品 化 试 剂 盒 按 说 明 检 测 乳 汁 中 牛 白 血 病 病 毒 抗 体，检 测 结 果 阳 性 即 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性。4.3 基 因 扩 增 试 验使 用 一 次 性 无 菌 采 血 设 备 采 集 待 检 牛 只 抗 凝 血，使 用 商 品 化 全 血 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 按 说 明 提取 全 血 中 的 D N A。核 酸 检 测 操 作 参 照 附 录 A 执 行，被 检 测 样 品 P C R 扩 增 产 物 基 因 序 列 与 牛 白 血 病 病 毒囊 膜 基 因 序 列 同 源 性 在 9 5%以 上，判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性。D B 2 3/T 3 0 3 8 2 0 2 125 检 测 后 处 理经 检 测 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性 牛 不 再 进 行 饲 养，淘 汰 阳 性 牛 后，使 用 次 氯 酸 钠、甲 醛、戊 二 醛等 敏 感 消 毒 剂 对 牧 场 进 行 消 毒，清 除 运 动 场、牛 舍、奶 厅、器 械、空 气 中 潜 在 的 病 毒 风 险。按 照G B 1 6 5 4 8 严 格 执 行 卫 生 防 疫 制 度，在 奶 牛 保 健、治 疗、护 理 时，避 免 交 叉 感 染。6 持 续 检 测 与 净 化启 动 净 化 程 序 后，采 取 检 测、淘 汰、消 毒 相 结 合 的 净 化 措 施 对 奶 牛 场 牛 白 血 病 进 行 持 续 净 化。每年 进 行 两 次 全 群 检 测，发 现 阳 性 牛 的 处 置 方 式 同 5。7 净 化 标 准 与 维 持按 照 规 模 化 奶 牛 场 主 要 动 物 疫 病 净 化 技 术 指 南 采 样 数 量 要 求 采 集 奶 牛 血 液，连 续 2 年 牛 白 血 病检 测 个 体 阳 性 率 小 于 0.1%可 列 为 假 定 阴 性 群。假 定 阴 性 群 无 需 再 进 行 全 群 检 测，转 为 按 照 不 低 于 1 0%的 比 例 进 行 抽 样 检 测，如 抽 样 检 测 不 符 合个 体 阳 性 率 小 于 0.1%要 求，则 按 照 4 6 推 荐 的 净 化 程 序 重 新 实 施 净 化。D B 2 3/T 3 0 3 8 2 0 2 13附 录 A（规 范 性 附 录）电 泳 法 检 测 牛 白 血 病 病 毒 囊 膜 基 因 核 酸 操 作 规 范A.1 引 物 序 列上 游 引 物 序 列 为 5-C A A C C G A T C A T C A G A T G G G T A A G-3，下 游 引 物 序 列 为 5-C A G G G A G C A T C T C C A A G T C T G-3。A.2 核 酸 扩 增 反 应 体 系2 5 L 核 酸 扩 增 反 应 体 系 如 下：双 蒸 水 1 8.3 L，待 测 D N A 样 品 1.0 L，上 游 引 物 0.5 L，下 游 引物 0.5 L，耐 热 缓 冲 液 2.5 L，2.5 m m o l/L d N T P s 2.0 L，耐 热 D N A 聚 合 酶 0.2 L。A.3 核 酸 扩 增 反 应 条 件9 4 预 变 性 5 m i n；9 4 变 性 6 0 s，6 0 退 火 6 0 s,7 2 延 伸 3 0 s，循 环 3 5 次；7 2 延 伸 6 m i n。A.4 电 泳 检 测制 备 2.5%琼 脂 糖 凝 胶 板。在 电 泳 槽 中 加 入 电 泳 缓 冲 液，使 液 面 刚 刚 没 过 凝 胶。取 5.0 L 扩 增 产 物分 别 和 适 量 加 样 缓 冲 液 混 合 后，加 到 凝 胶 孔。1 1 0 V 恒 压 电 泳 3 0 m i n，使 用 凝 胶 成 像 系 统 检 测 核 酸 扩增 结 果。A.5 判 定 标 准被 检 测 样 品 P C R 扩 增 产 物 出 现 7 9 b p 特 异 性 目 的 条 带，取 扩 增 产 物 进 行 测 序，与 牛 白 血 病 病 毒 囊膜 基 因 序 列 同 源 性 在 9 5%以 上，判 定 该 牛 患 有 牛 白 血 病。
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