实验动物 病原核酸液相芯片法定性分析DB44/T 2338-2021.pdf

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ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东 省 地方标准 DB44/T 2338 2021 实验动物 病原核酸 液相芯片 法定性分 析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogen nucleic acids with suspension array method 2021-10-18 发布 2022-01-18 实施 广东省市 场监督 管 理局 发 布 DB44/T 2338 2021 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.1 5.2 6.2 7.2 8.3 9.6 10.7 A.8 B.9 DB44/T 2338 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 GD/TC 93 DB44/T 2338 2021 1 实 验动物 病原核 酸液相 芯片法定 性分析 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 19495.2 3 术语和 定义 液相芯 片技 术 suspension array technology xMAP-100 4 缩略语 cDNA DNA complementary DNA CPE cytopathic effect DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribonucleic acid MFI median fluorescence intensity PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction RNA ribonucleic acid SA-PE-streptavidin R-phycoerythrin xMAP flexible multi-analyte profiling technology DB44/T 2338 2021 2 5 原理 PCR 5 TAG 3 5 TAG 2 5.6 100 PE Streptavidin SA-PE SA-PE SA-PE 6 主要设 备和 材料 PCR PCR-20 1.5 mL 2 mL 5 mL 15 mL 1 mL PCR 0.2 mL 96 90 mm 150 mm 20 min 7 试剂 GB/T 6682 DNA RNA DB44/T 2338 2021 3 1.25 107 beads/mL PBS A PCR DEPC DNA RNA A PrimeScript RT reagent Kit 注:PrimeScript RT reagent Kit PCR QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit 注:QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit SA-PE 1 mg/mL 1 TM A 5 TAG 3 Spacer 5 biotin HPLC 8 方法 生物安 全措 施 GB 19489 采样及 样本 的处 理 8.2.1 脏器组织 0.5 g 2.0 g 5 PBS 1 min 2 min 4 5 000 g 10 min 8.2.2 盲肠内 容物 或粪 便 1.0 g 2.0 g 5 mL 5 PBS 1 min 2 min 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.3 血液样 本 0.2 mL 0.5 mL EDTA 3 5 DB44/T 2338 2021 4 8.2.4 拭子取 样 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.5 细胞培 养物 CPE 15 mL 1 500 g 5 min 1 mL PBS 1.5 mL CPE 3 15 mL 8 000 g 5 min 15 mL 8.2.6 细菌分 离培 养物 1.5 mL 8.2.7 饲料、垫料 和饮 水 5 g 10 g 50 mL 3 PBS 5 min 10 min 15 mL 4 8 000 g 5 min 5 mL 1.5 mL 8.2.8 设施设 备 5 cm2 15 mL 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.9 样本的 存放 2 8 24 h-80 8.2.10 采样废 弃物 处理 样本核 酸提 取 8.3.1 DNA RNA 8.3.2 n 1.5 mL n+8.3.3 DNA 2 8-20 RNA DB44/T 2338 2021 5 PCR PCR-80 核酸扩 增 8.4.1 反转录(可 选)DNA PCR PCR RNA 1 37 25 min 85 5 s cDNA PCR PCR cDNA-20-80 500 ng Total RNA 表1 RNA 反 转录 反应 体系 L 5 PrimeScript Buffer 2 1 PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 Oliog dT Primer 0.5 25 pmol Random Primer 6 mers 0.5 50 pmol RNA 5 PCR 1.5 10 注:8.4.2 PCR 8.4.2.1 PCR 反 应体 系 PCR 2 No Template Control NTC 表2 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 buffer 10 1 2 200 nmol/L DNA/cDNA 4 PCR 4 20 8.4.2.2 PCR 反 应参 数 DB44/T 2338 2021 6 PCR 3 表3 PCR 反 应参 数 95 2 min 1 95 30 s 35 60 90 s 72 30 s 72 10 min 1 注:RT-PCR PCR 产 物杂 交 8.5.1 8.5.2 40 khz 20 s 8.5.3 2 500 1 Tm Hybrdization Buffer 125/8.5.4 SA-PE 1 mg/mL SA-PE 1 Tm Hybrdization Buffer 8.5.5 75 SA-PE 37 45 25 min 45 min 液相芯 片检 测仪 读取 荧光 8.6.1 PCR 45 8.6.2 8.6.3 8.6.4 75 50 60 s 8.6.5 8.6.6 30 min 9 结果 数据有 效性 分析 50 100 200 结果计 算 DB44/T 2338 2021 7 Luminex qualitative ratio result LQRR Median florescence intensity MFI MFI MFIB 1 LQRR=MFI/MFIB(1)LQRR MFI MFIB 结果 分 析与 定性 判定 9.3.1 LQRR 3 9.3.2 LQRR2 9.3.3 2 LQRR3 10 防止交 叉污 染的 措施 GB/T 19495.2 DB44/T 2338 2021 8 A A 附录A(规范 性)溶液的 配制 A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸 盐 缓 冲液(PBS)的配 制 A.1.1 A液 0.2 mol/L NaH2PO4 H20 27.6 g 1 000 mL A.1.2 B液 0.2 mol/L NaH2PO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 12H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1 000 mL A.1.3 0.02 mol/L pH7.2 磷 酸盐 缓冲液(PBS)的配 制 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 800 mL HCl pH 7.2 1 000 mL 121 15 min A.2 无RNase 去 离子 水的 配制 0.1%DEPC 121 15 min A.3 1TM 杂交 缓冲 液 NaCl 0.2 mol/L Tris 0.1 mol/L Triton X-100 0.08%pH 8.0 4 DB44/T 2338 2021 9 B B 附录B(资料 性)实验动 物病 原液 相基 因芯 片引物 表B.1 大小鼠 病原 液相 基因 芯片 引物列 表 5-3 TMEV TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GATCTAAGTYAACCGACTCC Bio-GAAGGAAGGGGCAACACATA MHV CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT Bio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG MNV TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-TCTGTYCTGCGCTGGGTGC Bio-GCTGCGCCATCACTCATCC III REO3 CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18-CCTCGCCTACGTGAAGAAGT Bio-CATCATCGAGTCCCTGGGTG MVM MVM TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-TTGTTCCACCACCACTAAATG Bio-GGTTTGTGTTCAAGATCTAGTTC MPV MVM ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CACCAGCAACAGACAACCAA Bio-TGAATGCGTTGAGTGTTCTC LCMV AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-GAGTCCAGAAGCTTTCTGATGTCAT Bio-CAAGTATTCACACGGCATGGAT HV ATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GGACACAATCAATGGGGATACAAC Bio-CCATATCATCCCCTAAGTGGAA SV CTAAACATACAAATACACATTTCA spacer18-CCCAGCCATATACTCAGTCGTGCT Bio-TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC PVM ATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GATCACAGAGCCCGTCAAAAT Bio-CATATAACATCCAATACGAGTTTGAA EDIM AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-ATCAAGCACGATTTGGAAC Bio-GATTCAGTTCGCAATGTAAGTCC DB44/T 2338 2021 10 表B.1 大 小鼠 病原 液相 基 因芯片 引物 列表 5-3 Mpul TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-AGCGTTTGCTTCACTTTGAA Bio-GGGCATTTCCTCCCTAAGCT ECT CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TACGGTGTATATGGCTACTCA Bio-ACTGCTGCTTCCTATACTCG MAD TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-AGACTCACACTGCGTATAGTCC Bio-CCAGAACTCGGTTATCCCCA MCMV CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-GCCCTCTTCATCCCTTACCT Bio-GACCTCCATGTCCTTCATGC POlY ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT Bio-TCAGTCAGCCATAGATGCAA RCV CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT Bio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG RTV ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-GGAAACTTAGAGCAGACATCG Bio-TCCACAGAGAACAACCATCG RMV RMV TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-Spacer18-ACACCATGCCAACTGCAGATG Bio-ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTGTT RRV RPV AATAACAACTCACTATATCATAAC-Spacer18-GATGATAAGCGGTTCAGGG Bio-AAGAGCTCCGGTATCTCTGTC H-1 H1 CTAAACATACAAATACACATTTCA-Spacer18-CTCTAGCAACTCTGCTGAAG Bio-CAGTTATTCCTTGGAGGCAT KRV KRV ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-Spacer18-AACCAGACGCTGGAATCGCTAA Bio-TGTAGCAGTCTAGATGCATGA IC ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-CGCAGAATCGCAAATACAC Bio-TAACAATAAGCTCGCAGTCG DB44/T 2338 2021 11 表B.2 兔病原 液相 基因 芯片 引物 列表 5-3 RHDV CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-CTCTCCACAAAATAACCCATTCACA Bio-CCAACCCTGGTCCAATCTCG RRV TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-ATGGTTCGCTTGTGTCTTAGTTG Bio-ATGCGTTGGGTGTAGTTCCTGTA SV CTAAACATACAAATACACATTTCA-spacer18-TGACAACAAACGGAGTAAACGC ACCATAGGTCCAAACAGCCATTC 表B.3 猴病原 液相 基因 芯片 引物 列表 5-3 SIV CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-ACGACCCGGCGGAAAGAAAAAGT Bio-TGCACCAGATGACGCAGACAGT T STLV TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GTGCCAATCATGGACCTGCC Bio-TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG SRV ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-AYGGGGCTACTGCYCCATA Bio-GCCATTACCKGCYTGTTGATT 表B.4 禽病原 液相 基因 芯片 引物 列表 5-3 AIV TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-ATGAGTCTTCTACCCGAGG Bio-TCAGAGGTGACAGGATTG NDV ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC Bio-ATGGAGTCACCAAGGGG IBV ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC Bio-GCATTGTTCCTCTCCTCATC ILTV ATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GCAGCGAAAAGAAGGC Bio-TCATCGTGCTCGGTGTCC MG CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18-ATCTAAAACCGTGTTGCTAA Bio-AGGAGGTAATCCACCCCCA DB44/T 2338 2021 12 表B.4 禽 病原 液相 基因 芯 片引物 列表 5-3 MS CTTTCTTAATACATTACAACATAC-spacer18-CCTTTTAGACTGGAATAACGGT Bio-GCTAATGTTCCGCACCC CAV ATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GCTCTCCAAGAAGATACTCCA Bio-GCATTCGCGCAGCCACAC MDV TACTTAAACATACAAACTTACTCA-spacer18-CCCATTCCCTCTTCTGCC Bio-GCTGAGCGTAAACCGTC IBDV TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-ATGCGGAGCCTTCTGA Bio-ATTAGCCCTGACCCTGTG REO ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-GGATTCCGTCTCCATTCT Bio-GAGTTTCCGTCAACCGTA REV CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-GACTGCCTTGTGACTGCT Bio-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC ALV CTAAACATACAAATACACATTTCA-spacer18-CTGATGCAACAACCAGGAAA Bio-GCAGTAACATTAGTGACATACCC AAV CAAACAAACATTCAAATATCAATC-spacer18-GCGCCBACYCGVAAYGTCA Bio-TTGAARGAVGGHCCBCKGTC AEV AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-GTTGAGGATAAGGAACCACAGG Bio-TTACCAGGAGCTAATTCAGGGA DB44/T 2338 2021 13 DB44/T 2338 2021*563 1304 510220 020-84250337 DB44/T 2338 2021
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