实验动物 病原菌PCR定性分析DB44／T 2337-2021.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东 省 地方标准 DB44/T 2337 2021 实验动物 病原菌PCR 定性分析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogenic bacteria with polymerase chain reaction method 2021-10-18 发布 2022-01-18 实施 广东省市 场监督 管 理局 发 布 DB44/T 2337 2021 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.1 5.2 6.2 7.2 8.3 9.6 10.7 A.8 B.10.13 DB44/T 2337 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 GD/TC 93 DB44/T 2337 2021 1 实 验动物 病 原菌 PCR 定性 分析 1 范围 PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 14926 GB 19489 GB/T 19495.2 3 术语和 定义 聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction，PCR DNA DNA DNA DNA DNA dNTP 实时荧 光聚 合酶 链式 反应 real-time PCR，实 时荧 光 PCR PCR PCR PCR PCR Ct 值 cycle threshold PCR 4 缩略语 DNA deoxyribonucleic acid EDTA ethylenediamine tetraacetic acid DB44/T 2337 2021 2 PBS phosphate buffered saline RNA ribonucleic acid TAE-tris-acetate-EDTA 5 原理 DNA 16s RNA PCR PCR 6 主要设 备和 材料 PCR PCR PCR-20 1.5 mL 2 mL 5 mL 15 mL 1 mL PCR 0.2 mL 96 90 mm 150 mm 20 min 7 试剂 GB/T 6682 DNA RNA PBS A DNA DNA DNeasy Blood&Tissue Kit 注：DNA Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit DNA PCR Premix Taq TM Version 2.0 plus dye Premix Ex Taq Probe qPCR DB44/T 2337 2021 3 注：PCR Takara PCR DNA 100 bp 2 000 bp 50 TAE A 10 mg/mL A 1.5%A B B.1 B.2 DNA RNA-20 4 8 方法 生物安 全措 施 GB 19489 采样及 样本 的处 理 8.2.1 脏器组 织 0.5 g 2 g 5 PBS 1 min 2 min 4 8 000 g 10 min 5 mL 8.2.2 细菌培 养物 GB/T 14926 1 mm2 3 mm2 8 000 g 1 min PCR 8.2.3 盲肠内 容物 或粪 便 0.5 g 2.0 g 5 PBS 1 min 2 min 8 000 g 5 min 8.2.4 血液样 本 0.2 mL 0.5 mL EDTA 3 5 8.2.5 拭子取 样 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5 mL DB44/T 2337 2021 4 8.2.6 饲料、垫料 和饮 水 5 g 10 g 50 mL 3 PBS 5 min 10 min 15 mL 4 8 000 g 5 min 5 mL 200 1.5 mL 8.2.7 设施设 备 5 cm2 15 mL 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 8.2.8 样本的 存放 2 8 24 h-80 8.2.9 采样废 弃物 处理 核酸提 取 8.3.1 50 L 100 L 1.5 mL 2 mL 20 L K PBS 220 L 8.3.2 AL 56 10 min 8.3.3 8.3.4 8.3.3 2 mL 6 000 g 1 min/8.3.5 2 mL AW1 6 000 g 1 min/8.3.6 2 mL AW2 20 000 g 3 min/8.3.7 1.5 mL AE 1 min 6 000 g 1min DNA 8.3.8 DNA DNA 8.3.9 DNA PCR PCR-20 注：DNA DNA DNeasy Blood&Tissue Kit DNA 普通PCR 8.4.1 PCR 反 应体 系 PCR 1 DB44/T 2337 2021 5 No Template Control NTC 表1 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 Premix Taq Mix plus dye 10 1 Forward primer 0.8 Reverse primer 10 0.8 DNA 2 250 ng PCR 6.4/20/注1：PCR 注2：8.4.2 PCR 反应 参数 PCR 2 表2 PCR 反 应参 数 95 5 min 1 98 10 s 30 50 60 30 s 72 1 min/kb 注：B 8.4.3 PCR 产 物电 泳分析 50 TAE 1 TAE 1.5%PCR 1.5%DNA 3 V/cm 5 V/cm 实时荧光 PCR 8.5.1 实时荧光 PCR 反应 体系 PCR 3 No Template Control NTC DB44/T 2337 2021 6 表3 实时荧光 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 Premix Ex Taq Mix 10 1 Forward Primer 0.4 0.2 mol/L 1 mol/L Reverse Primer 0.4 0.2 mol/L 1 mol/L Probe 0.8 Rox 50 0.2/DNA 2 100 ng PCR 6.2/20/注1：Rox Rox PCR 注2：PCR 注3：8.5.2 实时荧光 PCR 反应 参数 PCR 4 Ct 表4 实时荧 光PCR 反应 参数 95 30 s 1 95 5 s 40 60 34 s 9 结果 普通PCR 9.1.1 质控标 准 A 9.1.2 结果判 定 9.1.2.1 9.1.2.2 实时荧 光PCR DB44/T 2337 2021 7 9.2.1 结果分 析和 条件 设定 9.2.2 质控标 准 9.2.2.1 Ct Ct 40 9.2.2.2 Ct Ct 40 9.2.2.3 Ct 35 PCR 9.2.3 结果判 定 9.2.3.1 9.2.3.2 Ct 35 9.2.3.3 Ct 35 40 PCR Ct 40 Ct 35 40 序列测 定 PCR 99%10 防止交 叉污 染的 措施 GB/T 19495.2 DB44/T 2337 2021 8 A A 附录A（规范 性）溶液的 配制 A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸 盐 缓冲液（PBS）的 配制 A.1.1 A液 0.2 mol/L NaH2PO4 H2O 27.6 g 1 000 mL A.1.2 B液 0.2 mol/L NaH2PO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 12H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1 000 mL A.1.3 0.02 mol/LpH7.2 磷 酸盐 缓 冲液（PBS）的 配制 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 800 mL HCl pH 7.2 1 000 mL 121 15 min A.2 50TAE 电 泳缓 冲液 A.2.1 0.5 mol/L 乙二 铵四 乙酸 二 钠（EDTA）溶液（pH8.0）EDTA-Na2 H2O 18.61 g 80 mL 5 mol/L pH 8.0 100 mL 121 15 min A.2.2 50 TAE 电 泳缓 冲液 配制 Tris 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA pH8.0 l00 mL 1 000 mL 121 15 min l A.3 溴化乙 锭（EB）溶液（10 g/L）20 mg 20 mL A.4 含0.5 g/mL 溴化 乙锭 的1.5%琼 脂糖 凝胶 的配 制 1.5 g 1 TAE l00 mL DB44/T 2337 2021 9,50 55 EB 3 mm 5 mm DB44/T 2337 2021 10 B B 附录B（规范 性）引物及 探针 序列 16sRNA PCR PCR B.1 PCR B.2 表B.1 普通 PCR 引物 5 3 bp Mycoplasma pulmonis Mpul-F AGCGTTTGCTTCACTTTGAA 266 55 Mpul-R GGGCATTTCCTCCCTAAGCT Helicobacter genus H-F CTATGACGGGTATCCGGC 780 55 H-R CTCACGACACGAGCTGAC Helicobacter hepaticus Hh-F ATGGGTAAGAAAATAGCAAAAAGATTGCAA 705 55 Hh-R CTATTTCATATCCATAAGCTCTTGAGAATC Helicobacter bilis Hb-F ATGGAACAGATAAAGATTTTAAAGCAACTTCAG 435 55 Hb-R CTATGCAAGTTGTGCGTTAAGCAT Helicobacter rodentium Hr-F TTGTGAAATGGAGCAAATCTTAAAAACT 191 55 Hr-R TAGCCAGTTTGGCATTCC(Helicobacter muridarum)Hm-F ATGACAAAAAAATATTCTTTCACAAAACTATTCATTGGT 807 55 Hm-R TTTATTTTAGATTCCATTTAACTGCTAAATCATCAATAGT Helicobacter typhlonius Ht-F AGGGACTCTTAAATATGCTCCTAGAGT 122 55 Ht-R ATTCATCGTGTTTGAATGCGTCAA Pasteurella genus PastF ATGGGAGTGGGTTGTACCA 165170 58 PastR CAATCTGTGTGRACACTTRC Heyl Pasteurella.pneumotropica Hey1 PastF ATGGGAGTGGGTTGTACCA 326 58 HeylR TTGCAGATACTTGCCCTTAC Jawetz Pasteurella pneumotropica Jawetz PastF ATGGGAGTGGGTTGTACCA 451 58 JawR GGCATCCTAAAATACCCATCC DB44/T 2337 2021 11 表B.1 普通 PCR 引物 5 3 bp Actinobacillus muris A.m F AAGCGGTCGGTTTTAGCTGT 255 58 A.m-R AAGCAGTTGGTT TTGGCTGT Streptococcus pneumoniae SP-F GGCTTAGAGGCTGTTCGT 701 58 SP-R ATCTCACCGTCTGTATAGA Corynebacterium bovis CB-F GGTGTGGGGATCTTCCACGAT 223 55 CB-R ACCACCTGTGAACAAGCCCA Salmonella typhimurium ST-F TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC 331 58 ST-R GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT Staphylococcus aureus Sau-F GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG 247 58 Sau-R TTAACCGTATCACCATCAATCG Corynebacterium kutscheri CK-F GCAACGCGAAGAACCTTACC 200 58 CK-R CCCGGCAGTCTCTCATGAGT Pseudomonas aeruginosa Pseu-F GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC 397 60 Pseu-R CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCGCT Klebsiella pneumoniae KP-F TGGCCCGCGCCCAGGGTTCGAAA 368 55 KP-R GATGTCGTCATCGTTGATGCCCAG O157 H7 Escherichia coli O157:H7 O157-F ATTGCGCTGAAGCCTTTG 499 55 O157-R CGAGTACATTGGCATCGTG Bordetella pseudohinzii Hinz-F CGTTCCGGTTGCCCAGAAG 318 62 Hinz-R GCCTTCGGCGGTCTTGTTGGTC Bordetella bronchiseptica Fla-F AGGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT 237 58 Fla-R TGGCGCCTGCCCTATC Shigella spp.ipaH-F CCTTGACCGCCTTTCCGATAC 611 58 ipaH-R CAGCCACCCTCTGAGAGTACT DB44/T 2337 2021 12 表B.1 普通 PCR 引物 5 3 bp Tyzzer organism TY-F GTGCTAGGTGTTGGGAAG 196 55 TY-R TACTTTACGTAGCCTGTCAA Mycoplasma gallisepticum MG-F AATGATGCGACTAAACCAA 408 55 MG-R TCCACCCACATACCCAA Mycoplasma Synoviae MS-F CGGTGATAACCCAACAGA 688 55 MS-R ACCCCTCCTTAATACGCT 注：Y T/C R A/G 表B.2 实时荧 光PCR 扩 增引 物和 探针 5 3 Mycoplasma pulmonis Forward primer GGAAATGCCCTAAGTATGACGG Reverse primer CGGATAACGCTTGCACCCTA Probe FAM-CCTTGTCAGAAAGCACCGGCTAACTATGTG-BHQ-1 Helicobacter hepaticus Forward primer GGCAATATTAACTTTGATATGG Reverse primer TTGGCATTAAACCCTTTG Probe FAM TGCTACTCCTGATATGATGGCTCTTG-BHQ-1 Helicobacter bilis Forward primer TACCACTGGAATGTAAAAGGCA Reverse primer CTTCTTTTAGCGTTACATACGGAGT Probe FAM CCACAAGTCCATGCGGCAACAGAAG-BHQ-1 Helicobacter muridarum Forward primer GAGATGATGTTAGGGAGGGGCTTGT Reverse primer CCTCTTACAAATGAGTTGCCCA Probe FAM-GGAACCACAGTTTGAGGGGCAGAC-BHQ-1 Helicobacter rodentium Forward primer TTGTGAAATGGAGCAAATCTCAAAAAC Reverse primer TAGCCAGTTTGGCATTCC Probe FAM-TTGTACTCACCGCCCGTCACACCAT-BHQ-1 Helicobacter typhlonius Forward primer GAGAGAAGATTATGACGGTATC Reverse primer CAGGATTTCACATCTGACTTAC Probe FAM-CTAACTCCGTGCCAGCAGCC-BHQ-1 注：FAM VIC BHQ1 MGB DB44/T 2337 2021 13 参考文 献 1 GB/T 14926 2 T/CALAS 20-2017 3 T/CALAS 24-2017 PCR 4 T/CALAS 40-2017 PCR 5 T/CALAS 43-2017 DB44/T 2337 2021 14 PCR DB44/T 2337 2021*563 1304 510220 020-84250337 DB44/T 2337 2021