黑土区甜叶菊组织培养育苗移栽技术规程DB15／T 2397-2021.pdf

ICS 65.020.01 CCS B05 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2397 2021 黑土区甜 叶菊组织 培养育苗 移栽技术 规程 Code of prctice of tissue culture and seedling transplanting of stevia in black soil area 2021-09-26 发布 2021-10-26 实 施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2397 2021 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区农 牧厅提 出。本文件 由内 蒙古 自治 区农 业标准 化技 术委 员会（SAM/TC 20）归 口。本文件 起草 单位：内蒙 古 农业大 学、内 蒙古 自治 区 农牧业 技术 推广 中心、扎 赉特旗 农牧 和科 技事 业发展中 心。本文件 主要 起草 人：杨 彦 明、刘复 伟、乌恩、陈 新宇、张 悦忠、李 志新、于 长生、潘 云鹤、董 津蒙、王凌云、白 桂香、艾 俊国、陶凤 英。DB15/T 2397 2021 1 黑土区甜 叶菊组 织培养育 苗移栽 技术规程 1 范围 本文件 规定 了内 蒙古 黑土 区甜叶 菊组 织培 养育 苗移 栽技术 的无 菌环 境准 备、无 菌苗培 养、组织 培养、试管苗 移栽 关键 技术。本文件 适用 于内 蒙古 自治 区呼伦 贝尔 市、兴安 盟、通辽市。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 13735 聚乙 烯吹 塑农 用地面 覆盖 薄膜 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 甜叶菊 stevia rebaudiana hemsl.菊科甜 叶菊 属多 年生 草本 植物，原产 于南 美巴 拉圭 和巴西 交界 的高 山草 地。4 无菌环 境准 备 4.1 湿热灭 菌 培养基（不 耐高 温成 分除 外）、无菌 水、玻璃 器皿（三角 瓶、空三 角瓶、培 养皿）、金 属器 械（剪刀、镊 子）等采 用高 压蒸 汽灭菌 锅进 行湿 热灭 菌处 理。灭 菌锅 内加 水至 底部 有水析 出，放入 物品、关 严盖子，调整温 度121，时间20 min。待温 度上 升 至95 以上 时，将 出气 阀 和安全 阀关闭；当 气压 降至0.05 Mpa 以下 时,出气 阀 和安全 阀打 开排 气，冷却 后开盖 取出。4.2 干热灭 菌 耐热器 械（部 分 玻璃 器皿、坩埚）采 用干 热灭 菌，利用烘 箱加 热到170，持续90 min。4.3 过滤灭 菌 植物激 素（6-BA、NAA、IBA）采 用过 滤灭 菌。采用 滤 膜网孔 直径0.45 m 以下 的微孔 过滤 灭菌器。4.4 灼烧灭 菌 无菌操 作器 械采 用灼 烧灭 菌。灼 烧灭 菌可 采用 接种 用电热 灭菌 器或 酒精 灯灼 烧灭菌。DB15/T 2397 2021 2 4.5 擦拭、喷雾 灭菌 桌面、墙面、双手、植物 材料表 面用药 剂涂 擦、喷 雾灭菌，用75%的 酒精或0.1%的 新洁尔 灭菌。超净工 作台 用75%的 酒精 喷洒。4.6 紫外线 灭菌 接 种 室、培养 室 定期 用紫外 灯 灭菌。打 开 室内 及超净 工 作台，用 紫 外灯 杀菌20 min 30 min，关闭紫外 灯，10 min 后 进入 缓冲间。4.7 熏蒸灭 菌 接种室 和培 养室 每年 用高 锰酸钾 和甲 醛混 合熏 蒸1 2次。熏 蒸时，关 闭房 间，用大烧 杯盛 装甲 醛和高锰酸 钾溶 液，用量 为甲 醛10 ml/m、高 锰酸 钾5 g/m，熏蒸2 d 3 d，2 d 3 d 后人 员方 可进 入。5 无菌苗 培养 5.1 种子处 理 取甜叶 菊种子，每10 粒1 份，在超 净工作 台内 将种子 装入无 菌离心 管中 消毒。75%酒精 消毒10 s 0.1%HgCl2 消毒6 min，每隔5 s 10 s 摇动1次 离心管，无菌水 冲洗45 次，后置于无菌 滤纸下吸干。用70%乙醇30 s 0.1%HgCl2 消毒6 min 15%H2O2 消毒20 min，每隔5 s 10 s 摇动1 次离 心管，无 菌水冲洗4 5次，后 置于 无菌 滤纸下 吸干。5.2 种子装 瓶 将灭菌 后装 有培 养基 的三 角瓶在 超净 工作 台内 打开，封 口膜 倒放 于台 面。将 消 毒、吸水 干燥 后的 种子用镊 子均 匀播 于培 养基 上，播 后将 瓶口 用 酒 精灯 灼烧灭 菌，冷却 后封 口、扎紧。5.3 种子培 养 将播种 后的三 角瓶 在25 恒温培 养箱内 暗培 养至发 芽后，继续保 持光 照10 h/d 16 h/d 培 养至 苗高3 cm 5 cm 待 用。6 组织培 养 6.1 培养基 选择 及制 备 6.1.1 MS 培 养基 取40 gMS 粉，溶 于1 L 蒸 馏 水，调pH为5.8，加 琼脂5 g，灭 菌20 min 后，冷却 备 用。6.1.2 1/2MS 培养 基 取20 gMS 粉，溶 于1 L 蒸 馏 水，调pH为5.8，加 琼脂8.5 g，灭菌20 min 后，冷 却 备用。6.1.3 诱导培 养基 MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L琼脂。DB15/T 2397 2021 3 6.1.4 增殖培 养基 MS+1.0 mg/L6-BA+O.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂。6.1.5 生根培 养基 1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/LIBA+20 g/L 蔗糖+7 g/L 琼 脂。6.2 材料选 择及 接种 取无菌 苗上 的带 腋芽 茎段 作为外 植体，用蒸 馏水冲 洗干净，将茎 段切 割成1 cm 左右带 腋芽 小茎 段，于超静 工作 台上 用75%酒 精消毒10 s，再 用0.1%HgCl2 消毒6 min，每隔5 s 10 s 搅动1 次，无菌 水冲洗5次，消毒 处理后 的外 植 体，接 种在MS 培养 基中，约30 d 后腋芽 长成 芽苗。无菌苗 可作为 组织 培养 外植体，在超 净工 作台 中将 无菌苗 切下1 cm 左右 小段，转移 至诱 导培 养基。6.3 培养条 件 培养温 度为24 28，光照 时间 为16 h/d，光 照强度 为2000 lx。6.4 试管苗 增殖 将无菌 苗切 成单 株，接种 于增殖 培养 基中，每 瓶接 种5株。6.5 试管苗 生根 选取生 长状 态基 本一 致的 试管苗，并 将苗 切成 单株，接种 于生 根培 养基 中，每瓶接 种5 株。7 试管苗 移栽 7.1 试管移 栽 将 试 管 苗根 部 培养 基 清洗干 净 移 栽于 苗 盘，以 湿润河 沙 为 栽 培 基 质，覆 盖塑料 薄 膜，温 度 控制 在20 30，中午 适当 遮荫，20 d 后统 计试 管苗 成活率。塑 料薄 膜使 用符 合GB 13735 的规 定。7.2 大田移 栽 当地日 平均 气温 稳定 在12 15，0 cm 10 cm 地 温稳定 在10 以上，且 晚 霜结束 后即 可大 田移栽。