软枣猕猴桃品种鉴别技术规程 SSR分子标记法DB21／T 3559-2021.pdf

DB21 辽宁省地方标 准 DB21/T 3559 2021 软枣猕猴 桃品种鉴 别 技术规 程 SSR 分子标记法 Technical regulation for the identification of Actinidia arguta SSR marker method 2021-12-30 发布 2022-01-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布ICS 65.020.01 CCS B 60 DB21/T 3559 2021 I 目 次 1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语 和定 义.1 4 测试 准备.2 5 DNA 提取.2 6 PCR 扩增.3 7 PCR 扩增 产物 检测.3 8 指纹 比对.3 9 数据 记录.3 10 结 果判 定.3 附录A（资 料性）仪器 设 备与主 要试 剂、耗材.4 附录B（资 料性）溶液 配 制.5 附录C（规 范性）核心 引 物.6 附录D（规 范性）软枣 猕 猴桃 SSR 等 位基 因数 据记 录格式.7 附录E（规 范性）软枣 猕 猴桃 SSR 指 纹图 谱鉴 别报告.8 DB21/T 3559 2021 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1-2020 标 准化 工作导 则 第1 部 分：标准 化文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起草。本文件 由辽 宁省 林业 和草 原局提 出并 归口 管理。本文件 起草 单位：辽 宁省 经济林 研究 所。本文件 主要 起草 人：刘振 盼、尤 文忠、孙 阳、周狄、李仁 浩、李冬 生、陈喜 忠、张 雪梅、卢立媛、徐开源、宋 建宇、郝 家臣、于雷。本文件 发布 实施 后，任何 单 位和个 人如 有问 题和 意见 建议，均可 以通 过来 电和 来 函等方 式进 行反 馈，我们将 及时 答复 并认 真处 理，根 据实 际情 况依 法进 行评估 及复 审。归 口 管 理 部 门 通 讯 地 址：辽 宁 省 林 业 和 草 原 局（沈 阳 市 和 平 区 太 原 北 街2 号），联 系 电 话：024-23448927。文件起草单位通讯地址：辽宁省经济林研究所（大 连 市 甘 井 子 区 中 华 西 路31 号），联 系 电 话：0411-86515158。DB21/T 3559 2021 1 软 枣猕猴 桃品种鉴 别技术 规程 SSR 分 子标记 法 1 范围 本 文件规定 了 利 用 简 单 重 复 序 列（Simple sequence repeats，SSR）分 子 标 记 法 对 软枣猕猴桃（Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)Planch.ex Miq.）材料进 行鉴 别过程 中 样品 准备、DNA 提 取、PCR 扩增、PCR扩 增产 物检 测、指纹 比 对、数 据记 录、结果 判定 等方面 的技 术要 求。本 文件 适用 于SSR 分 子标 记 技术构 建软 枣猕 猴桃 资源DNA 指纹 图谱 过程 中DNA 分 子 数据采 集和 鉴别。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 19557.1 植物 新品 种 特异性、一 致性 和稳 定性 测试指 南 总则 LY/T 2745 仁用 杏品 种鉴 定技术 规程 SSR 分 子标 记 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 PCR 指 聚合酶 链反 应（polymerase chain reaction，PCR)，是利 用一段DNA为 模板，在DNA 聚合酶 和核苷酸底 物共 同参 与下，将 该段DNA 扩 增至 足够 数量，以便进 行 检 测分 析。3.2 SSR 分 子标 记 SSR molecular marker 又称微 卫星 标记，由 于每 个简单 重复 序列 两端 的序 列是高 度保 守的 单拷 贝序 列，因 而可 根据 两 端 的序列设 计特 异性 引物，利 用PCR 技术 对两 条引 物间 的DNA重 复序 列进 行扩 增，通 过电泳 可以 区分 不同 大小的扩增 产物 片段，经 荧光 染料标 记加 以区 分。3.3 待检样品 test sample 待鉴 别 的软 枣猕 猴桃 样品，由送 检人 提供。3.4 对照样 品 control sample DB21/T 3559 2021 2 用于与 待检 样品 进行 指纹 比对的 样品，由 送检 人提 供。3.5 核心引 物 core primer 扩增产 物具 有高 度的 稳定 性和一 致性（无 干扰 谱带），并 具有 较强 的鉴 别能 力，可 以用 于建 立 软 枣猕猴桃 比对 的人 工合 成引 物。3.6 SSR 指 纹图 谱 SSR fingerprint 采用SSR 核 心引 物（或相 当 于核心 引物）扩 增出 的待 检 样品 和 对照 样品 的DNA 片 段，通过 毛细 管电 泳，得到不 同大 小的DNA 片段 图 谱。3.7 指纹对 比 fingerprint comparison 将待检 样品 与对照 样品的SSR 指 纹 图谱 进 行 比对，分析 待 检 样品 与对照 样品的SSR 指 纹 是否 具 有差异，并 确定 其大 小。4 测试准 备 4.1 仪器设 备与 主要 试剂、耗 材 仪器设 备与 主要 试剂、耗 材参见 附录A。4.2 溶液配 制 溶液配 制方 法参 见附 录B。4.3 核心引 物 核心引 物信 息参 见附 录C。4.4 样品准 备 依据NY/T 2324 中样本采 集的技术规定进行样本采集，3次以上重复。取无病虫害的健康的芽，做好标记 后，蒸馏 水清 洗后-80 保 存。5 DNA 提取 a）将样品 倒入 研钵 中，加入 液氮研 磨2 次，约取0.1 mL 放入1.5 mL 离心 管；b）加入900 L 2.5%CTAB 提 取液，65 水浴60 min，每10 min颠倒，混匀；c）10000 r min-1离心1 min，取上清650 L，加650 L氯仿 异 戊醇（24:1）混 合液，混匀；d）10000 r min-1离心5 min，取上清400 L，加 入800 L无 水乙 醇，-20 放置30 min；e）5000 r min-1离心1 min 后倒掉上清液，用70%乙醇洗3 次，自然风干，再用50 LTE 溶解，置于4 备用 或保 存；f）用琼脂 糖凝 胶电 泳法 检测DNA 提取 质量，要求 电 泳条 带清晰 明亮；DB21/T 3559 2021 3 g）用紫 外分光光 度 法测定 纯度和 浓度，OD260/OD280 比值范 围在1.71.9 之间 即为可用DNA 样品，将其最 终质 量浓 度调 至20 ng L-1。6 PCR 扩增 6.1 PCR 反 应体 系 总体积 为20 L，其中6.0 L ddH2O，10 L 2 Taq master mix，2.0 L DNA 模板（20 ng L-1），1.0 L F-primer（20 mol L-1，5 端 饰有FAM 荧 光标记），1.0 L R-primer（20 molL-1）。6.2 PCR 扩 增程 序 PCR扩增 程序 为：94 预 变 性5 min，9430 s，5530 s，7230 s，共35 个循 环，最后7210 min，4保 存。7 PCR 扩 增产 物检 测 7.1 标样准 备 取PCR 产物0.3 L、LIZ500 分子 量内 标0.5 L和 去 离子甲 酰胺9.5 L混 合加 入PCR 板，95 变性5 min，4 冷 却后 离心，加1.0 L1 Buffer 缓 冲液。7.2 上机检 测 参照LY/T 2745 中毛 细管 电 泳比对 方法。8 指纹比 对 根据待 检样 品与 对照 样品 的谱带 位置 进行 指纹 比对，确定 是否 具有 差异；根 据 各泳道 内分 子量 内 标的位置 与各 样品 峰值 的位 置比较 分析，确 定待 测样 品和对 照样品 的 片段 大小。9 数据记 录 数据记 录采 用统 一格 式，参见附 录D。10 结果判 定 10.1 判定方 法 将待 检 样品 与 对照 样品的SSR 指纹 比对结 果进 行分析，若待 检样品 与对 照 样品 有等位 基因不 同的 位点，则依 据该 位点 及其 等 位基因 的不 同，判 定两 者 不同；若 待 检 样品 与对 照 样品全 部位 点等 位基 因均 相同，则 判定 两者 为 疑 似相 同。10.2 判定结果 根据10.1 的 判定 结果，出 具鉴 别 报告 书，参见 附录E。DB21/T 3559 2021 4 A A 附 录 A（资料 性）仪器设 备与 主要 试剂、耗 材 A.1 仪器设 备 冰箱（4、-20）精 密天平（精 度0.001 g以 上）、酸 度计、2.5 L移 液 器、10 L 移液 器、100 L移 液器、1000 L 移液器、水 浴锅、高压 灭 菌锅、台式 离心 机（10000 rmin-1或以 上），紫 外分光光 度计、磁 力搅 拌器、PCR 扩增 仪、3730XL测序仪、琼 脂粮 凝胶 电泳 仪，凝胶成 像系 统。A.2 主要试 剂 液 氮、三 羟 甲基 氨基 甲 烷盐 酸 盐（Tris-HCl）、乙二 胺 四乙 酸 二钠（EDTA-Na2）、十 六烷 基三 甲基溴化 铵（CTAB）、氯 化 钠（NaCl）、聚 乙烯 吡咯 烷 酮（PVP）、氯仿：异 戊醇（24:1）、2Taq master mix、引物、琼 脂糖、去 离 子水、无水 乙醇、双 蒸水、硼酸、B.3 TBE 电泳 缓 冲液。A.3 主要器 材 量筒、玻璃 棒、研钵、1.5 mL 离心 管、移液 器配 套 枪 头（2.5 L、10 L、100 L、1000 L）、PCR管、96 孔板。DB21/T 3559 2021 5 B B 附 录 B（资料 性）溶液配 制 B.1 DNA 提 取溶 液的 配制 B.1.1 1 mol L-1三 羟甲 基氨 基甲 烷盐酸 盐（Tris-HCl）溶 液（pH8.0）称取30.28 gTris 于250mL 烧杯中，加150 mL去 离子 水 充分搅 拌溶 解，用1 molL-1 HCl溶 液调pH至8.0，定容至250 mL，混匀。棕 色瓶分 装，4 冰箱 保存。B.1.2 0.5 mol L-1乙二 胺四 乙酸 二钠盐（EDTANa2 2H2O）溶液（pH8.0）称取46.53 g EDTANa2 2H2O于250 mL 烧 杯中，加150 mL 去离子水充分搅拌 溶解，用1 mol L-1 NaOH溶液调pH至8.0，定 容至250 mL，混匀。4 冰 箱保 存。B.1.3 DNA提 取液 依次称 取十 六烷 基三 甲基 溴化铵（CTAB）6.25 g、聚乙烯 吡咯 烷酮（PVP）5.00 g、氯化 钠（NaCl）20.454 g 至250 mL 烧 杯中，分别 加1 mol L-1 Tris-HCl 溶液25 mL、0.5 mol L-1EDTANa2 2H2O溶液10 mL，60水 溶解，并 用去 离子 水定容 至250 mL，混 匀。4 冰箱 保存。B.1.4 1TE 缓存 液 分别量取1 mol L-1 Tris-HCl 溶液2.5 mL、0.5 mol L-1EDTANa2 2H2O 溶液0.5 mL，用 去 离 子 水 定容至250 mL，混匀。4 冰 箱 保存。B.2 引物的 稀释 合成的 引物 在高 速离 心机 中10000 rmin-1离心2 min，加入 去离 子水 稀释 到浓 度为20 mol L-1。B.3 TBE 电 泳缓 冲液 将Tris108g、硼酸55g、40 ml 0.5 M EDTA 溶解 在600 ml 的去 离子 水中，调节pH 至8.3，加 去离 子水定容至1L后，室 温保 存。使用时 稀释10倍即 可。DB21/T 3559 2021 6 附 录 C（规范 性）核心引 物 C.1 核心 引物 本文件 中PCR 反 应体 系中 规 定使用 的引 物，用于 软枣 猕猴桃 样品 鉴别。表 C.1 核 心引 物 编号 引物名称 引物序列 目的片段 大小 F R 1 UDK-096 CCCAAAGTTCCTCACTCTTCC TAAACAAAAACCAAATCTGGCA 111 173 2 UDK-098 GTAAGGTTGGTACTGGCAGTCA TGCATGATTATGGTTGGCAT 75 200 3 UDK-099 TCCTATTATTGCTGACACGACA TGTTATAGGCCACCTCACTGG 65 85 4 UDK-103 TCTTCTTCCCTTTCTTGGCA GCTGTCTAGTCATTTCCCTCAA 100 167 5 UDK-104 ACATCTCGGCTGAAGATGCT AGGTTGCATATGAGTGGTTGC 135 192 6 UDK-106 CACCTGTCAAGCATTTGTAGAA GTGTTGCCAGTGAAGTTATGC 100 150 7 UDK-125 ACGAGCCCAAAATAGAGTTCA TGAGTGCAGCATAGCTACTTCC 200 269 8 UDK-128 GCTCTCGGGACTGTTTGGTA GCAACGTAAACTCCGTTAACG 119 210 9 UDK-131 CGGTGTGGAGAGGATACGAT AAGTAAAGCCATTGTCATTGCA 121 192 10 UDK-143 TGGTGTAAAGTCAAAAACAGCC AGAAGATTTCATTGTCCTCCCT 94 125 11 UDK-153 CCCCAGTGGAGATCACTTTC TGGATATCTTGCCCATCTCC 123 192 12 UDK-158 GCCCATCTAATCCGTACTCTG TCAATTGAAGCAACTCTTCTTGA 120 167 DB21/T 3559 2021 7 附 录 D（规范 性）软枣猕 猴 桃SSR 等位 基因 数据记 录格 式 D.1 软枣 猕猴 桃SSR 等位 基因数 据记 录格 式 本文件 中用 于软 枣猕 猴桃 软枣猕 猴桃SSR 等位 基因 数 据记录 的格 式标 准。D.1 软枣 猕猴 桃SSR 等位 基因数 据记 录格 式 引物名称 等位基因 1 大小 等位基因 2 大小 等位基因 3 大小 等位基因 4 大小.引物 1 引物 2 引物 3 引物 4.DB21/T 3559 2021 8 附 录 E（规范 性）软枣猕 猴 桃SSR 指纹 图谱 鉴 别报告 E.1 软枣 猕猴 桃SSR 指纹 图谱鉴 别报告 本文件 规定 的样 品鉴 别报 告格式。表E.1 软 枣猕 猴桃SSR 指 纹图谱 鉴 别 报告 送检样品编号 送检样品名称 对照样品 编号 对照样品名称 送检人 检测单位 依据标准 检测引物数量：检测引物编号：SSR 指纹图谱检测结果：检测差异引物和谱带：结论：评语：检测单位（公章）年 月 日 _