抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记法DB13／T 5524-2022.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 05 13 河北省地方标准 DB 13/T 55242022 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR分子标记法 2022-02-28发布 2022-03-31实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 55242022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北省农林科学院粮油作物研究所。本文件主要起草人：刘长友、田静、范保杰、曹志敏、王彦、王珅、苏秋竹、张志肖、王学清、刘少兴、彭秀国、刘阳。DB 13/T 55242022 2 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR分子标记法 1 范围 本文件规定了SSR分子标记法鉴定抗豆象绿豆（Vigna radiata L.）品种真实性和纯度的仪器设备及试剂、供试样品、方法步骤和结果判断与计算方法。本文件适用于抗豆象绿豆品种真实性和纯度的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.1 农作物种子检验规程总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。绿豆象(Callosobruchus Chinensis)绿豆象为鞘翅目、豆象科（Bruchidae)的一种昆虫，又叫中国豆象、小豆象、豆牛，在我国各地均有发生，主要危害绿豆、小豆、豇豆等。抗豆象绿豆品种(Bruchids Resistant Mungbean Variety)在人工接种豆象鉴定的条件下，种子被害率小于65%的绿豆品种。标准样品（Standard Sample）国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。品种真实性(Varietal Genuineness)供检品种与该品种的标准样品是否相符。品种纯度(Varietal Purity)品种在特征特性方面典型一致的程度，用与供检品种标准特征特性表现一致的本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。SSR 分子标记（Simple Sequence Repeats Marker）也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)标记，是基于单个微卫星位点的重复单元在数量上的变异而发展起来一种分子标记。微卫星中重复单位的数目在不同材料中存在高度变异，但其两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，根据这一特征设计引物进行PCR扩增，从而可以将单个微卫星位点扩增出来。由于重复单元的重复数目不同就产生扩增片段长度的多态性，从而形成分子标记。核心引物（Core Primers）从大量引物中筛选出的一组扩增稳定、多态性较好、带型分布合理、能够用于区分不同材料遗传背景差异的引物组合。DB 13/T 55242022 3 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。4 仪器设备及试剂 仪器设备 高速离心机；PCR 扩增仪；高压电泳仪（3000 V,400 mA,400 W）；DNA 序列分析电泳槽；电子天平（0.01 g,0.001 g）；研钵或组织研磨仪；水浴锅；通风橱；微量加样器（0.5 L10 L,20 L200 L,100 L1000 L）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计；冰箱；Nanodrop2000分光光度计；烧杯；镊子；量筒；容量瓶（500 mL，1000 mL）；离心管（1.5 mL，2 mL）；吸头(10 L，200 L，1000 L)；96 孔 PCR 板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒；水平仪；夹子等。试剂 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠；三氯甲烷（氯仿）；异戊醇；-巯基乙醇；三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）；37%浓盐酸；乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA-2H 2O)；氢氧化钠；硼酸；40%非变性聚丙烯酰胺母液（19:1）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；硝酸银；甲醛；乙醇。注：所有试剂均为分析纯 溶液配制 DNA 提取及电泳相关试剂储备液配制见附录B。试剂配制所用水应符合GB/T 6682规定的一级水的要求，其中银染、显影溶液的配制可以使用符合三级水的要求。5 样品 送样 送验样品为种子，重量应不低于500 g。试验样品 从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取符合GB/T 3543.2的规定。品种真实性鉴定试样采用混合试样，混合试样应至少含有15个个体；纯度鉴定试样不少于100粒种子；检测样品可以是种子、胚芽、幼苗或叶片。6 方法步骤 DNA 提取 6.1.1 取参试样品种子，利用研钵或组织研磨仪研成粉末，置于 2 mL离心管中，加入 800 L 65 预热的2%CTAB DNA提取液(配方见表B.3)，涡旋震荡 1 min。6.1.2 将离心管置于 65 水浴40 min，每 10 min 颠倒混匀一次。将样品从水浴锅中取出，静置片刻，加入800 L氯仿与异戊醇的混合液（24 氯仿:1 异戊醇），混匀 15 min，然后静置10 min，10000 r/min室温离心 10 min。6.1.3 取600 L上清液于另一新的 2 mL 离心管中，加入 900 L 95%乙醇，-20 放置 30 min。10000 r/min 离心 10 min，倒掉上清液，留沉淀。6.1.4 加入500 L 75%乙醇，轻轻将沉淀弹起，10000 r/min 离心 5 min，倒掉上清液。6.1.5 重复步骤6.1.4一次。6.1.6 将离心管开口朝下倾斜放置，便于多余乙醇流出，室温干燥 1 h 或50 烘干 20 min。加入150 L灭菌 ddH2O 或 1TE（配方见表B.4），置 65 水浴锅溶解1 h。DB 13/T 55242022 4 6.1.7 取出离心管，放置至室温，10000 r/min离心 2 min，将上清液吸取到新的1.5 mL离心管中，以便去除淀粉等沉淀物。6.1.8 利用超微量核酸蛋白检测仪进行 DNA浓度测定和质量检测，其OD260 与 OD280的比值应介于1.72.0之间，并稀释到20 ng/L 备用。PCR 扩增 6.2.1 PCR 反应体系 利用本标准附表A.1中给出的30对绿豆SSR核心引物对受检样品DNA 及标准样品DNA进行PCR 扩增。在冰盘中或4 条件下按表 1 所列成分和用量,依次加入PCR管,准备PCR反应体系。表1 PCR 反应体系 成份 用量 L DNA 模版（20 ng/L）4 正向引物（2 mol/L）1 反向引物（2mol/L）1 2UTaq PCR MasterMix 10 ddH2O 4 总体积 20 注：2UTaq PCR MasterMix 包含 Utaq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液，浓度为 2，含溴酚蓝和二甲苯青电泳指示剂 6.2.2 PCR反应程序 按表 2 程序设置 PCR 反应流程。表2 PCR 反应程序 反应步骤 程序设定 反应时间 备注 1 95 预变性 5 min 2 95 变性 30 s 3 55 退火 45 s 不同 SSR 引物所需的退火温度有差异 4 72 延伸 45 s 5 循环次数 35 次 从步骤 2 到步骤4 的循环次数 6 72 延伸 10 min PCR产物电泳分析 6.3.1 电泳玻璃板准备 电泳采用340 mm110 mm电泳玻璃板，用洗涤剂仔细清洗,自来水漂洗干净,然后用蒸馏水冲洗,最后用75%乙醇擦拭,并空置晾干。6.3.2 胶板制备 采用8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺凝胶，其配制方法见附录B表（表B.5）。取40 mL 8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺胶，加入TEMED 40 L，10%过硫酸铵400 L，混匀，灌胶。灌胶完毕后立即插入102齿高通量制胶梳，放置20 min 以上，以便凝胶完全凝固。DB 13/T 55242022 5 6.3.3 电泳 将胶板组装到电泳槽中，加入0.5TBE缓冲液。每个样品取1 LPCR 产物进行点样，同时点DNA marker（最小片段100 bp）作为扩增片段大小的指示标记。设置电泳电压为260 V，每板额定功率30 W；电泳时间根据扩增产物大小进行调整，一般可在二甲苯青指示剂条带刚刚跑出胶板时停止电泳。6.3.4 银染 下板后将凝胶从玻璃板上取下，用蒸馏水冲洗凝胶12次，以洗掉残留的电泳缓冲液。用终浓度为0.1%（w/w）的AgNO3染色液染色 10 min。6.3.5 显影 用蒸馏水冲洗凝胶12次，然后使用1.5%（w/w）NaOH（含0.5%甲醛）溶液进行显影5 min10 min，然后用蒸馏水充分漂洗凝胶，终止显色反应。6.3.6 电泳结果记录和分析 6.3.6.1 将凝胶平铺在玻璃板上，用保鲜膜封住，拍照。参照DNA Marker电泳结果，根据每对 SSR 引物从标准样品和检测样品中扩增出的条带数及其分子量大小，按 有 对应条带记录为 1，无 对应条带记录为 0 的方法记录每对 SSR 引物的 PCR扩增结果。在引物等位变异片段大小范围内（见表A.1）,特异谱带呈现单谱带或2种谱带。位于等位变异片段大小范围外的谱带需要甄别是非特异性扩增还是新增的稀有等位变异。采用单个个体扩增的产物，出现3种或3种以上的多带则为非特异性扩增；采用混合试样提取的，某些位点出现3种或3种以上的谱带，则需要通过单个个体进行甄别。6.3.6.2 品种真实性鉴定采用与标准样品进行比较，对甄别后的特异谱带，在同一电泳板上的供检样品与标准样品逐个位点比较，确定差异位点。6.3.6.3 品种纯度采用包括序号12、30的引物在内的10个引物对样品进行分析，当某个体的谱带在2个以上位点与其他个体存在差异时，为非典型个体。7 结果判断与计算 抗豆象绿豆品种真实性判断 利用附录A中30个SSR标记对样品和标准样品电泳分析的结果，计算差异位点数量，核实差异位点编号。检测结果用样品和标准样品比较的位点差异数表示。若在所检测的30个SSR标记中：a)受检样品与标准样品差异标记数2，判读为不同品种；b)受检样品与标准样品差异标记数=1，判读为近似品种；c)受检样品与标准样品差异标记数=0，判读相同或极近似品种。品种纯度计算 检测结果使用正常个体数目（检测试样总数减去非典型个体数目）占检测试样总数的百分率表示，按式1计算品种纯度。P=(1/)100%(1）式中：P 受检样品品种纯度；S 非本品种特征谱带粒数；T 受检样品总粒数。8 结果报告 8.1 真实性鉴定 按照GB/T 3543.1的检验报告要求，对品种真实性鉴定的检测结果可以选择下列方式之一进行填报：DB 13/T 55242022 6 a)通过 对引物，使用混合试样采用 8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行检测，与标准样品比较未能检测出位点差异；b)通过 对引物，使用混合试样，采用 8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行检测，与标准样品比较检测出差异位点 个，差异位点的引物编号为。8.2 纯度测定 按照GB/T 3543.1的检验报告要求，对品种纯度的检测结果按下列方式进行填报，即：通过编号为 的引物，检测了 个个体，采用8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，检测出其他类型杂株 个，品种纯度为%。DB 13/T 55242022 7 A A 附录A（资料性）SSR 标记信息 表A.1规定了30对绿豆SSR核心引物及相关信息。表 A.1 SSR标记引物信息 序号 引物名称 正向引物（5-3）反向引物（5-3）退火温度/染色体 等位变异扩增片段范围/bp 1 syd21 TCTCTTCCTCTATGGCTT GCTCCTCTTTTTGCTGCA 55 7 180-248 2 syd72 GCTTCACATGCATAGTAC TTAACTTGGGTTGTCTGC 55 10 110-158 3 syd102 CTCATTGTACCACTGGAT GCCTCCTTTCAGGTGATT 55 10 124-160 4 syd114 AGAAGAACCCTACCACAG CCAAAAACGTTCCCTCAG 55 2 134-171 5 syd169 GTCGTTTCCGGAAACTGT GATCCGAACCTCTTTCTG 50 9 169-249 6 syd181 GAAGGGAATGAAAATGAA GTTCAATCCATTCAGTCT 50 11 124-184 7 syd261 CATGCAGACGAAGCAGAG GAGCGTCGTCGTTTCGAT 50 6 125-155 8 syd316 AAGCACTGGCTTCACCAG TCGCAGCATTTGAAAAAT 50 9 170-210 9 syd358 GTGATGGTGCTGCTTTTC ATGCGTGGGGAGAAGTAA 50 2 190-257 10 syd361 TTCACACCCTTTTCTGATTC GTTTCCTTCTTGGTCTCC 50 8 146-186 11 syd387 TGGAACTCCTTCCCCTCTTT GGAAGCGAGTCCACGAGTAG 50 5 215-265 12 syd404 ACGGCTATTCATCGTTTTGC CAACCCGAAGCCAAAAACTA 55 5 144-184 13 syd431 CAGCAACGGAAAGAAAATCG TGTTGTGAAGGCACCAACAT 50 3 201-241 14 syd510 TCTGCGAAAATCTTCTTCCAA GGTGGGGAAAAGAACCCTAA 50 9 154-194 15 syd550 AAGACTAAAAGGCGCCGAAC AAGGAGAAAGATACCGTTTTCAGA 50 11 216-266 16 syd643 ACGTTCATTGTTCCTTTCCCTCTG GTGCTCGAAGAGTTCGTCTTCCTC 55 5 216-256 DB 13/T 55242022 8 表A.1 SSR标记引物信息（续）序号 引物名称 正向引物（5-3）反向引物（5-3）退火温度/染色体 等位变异扩增片段范围/bp 17 syd648 CATTCAACGCTGTGTAAGGTCCAG TTGCAGAAGAGCTTTGTGATGAGG 55 6 235-285 18 syd672 CCCACTGCAGAGGTTATCGT GAAGATCCAGCACAACCCAT 50 4 153-193 19 syd747 GCAGGCAATACGAGGAGTTC AGGGTCGGTCCATCAACATA 50 11 183-223 20 syd753 ATTCAAGCCAGAGAAGGCAA GGTGGGAGGGTATTGGCTAT 50 3 325-375 21 syd856 TCCAATGTTTGGTTTCATGTTT TCTGAGCTCTGAGGTGGGAT 55 1 248-288 22 syd934 TTCCCCTTTCTGCTTCTTCA ACGCTGACGTTGACTCCTCT 50 8 270-310 23 syd1083 ACGCAAAGAGAGGTGCAGAT TCCCTACCATTTTCCAGATCA 55 5 276-316 24 syd1145 GAGGTTCCAACATCTCAGCC GGATGGACAATGTTGTGCTG 50 4 147-197 25 syd1159 ATGTTTGAGGCATTTCCCTG ATCAGGCAACAACAACCACA 55 5 130-170 26 syd1303 CCGGGGTGAAATTGATACAC CAAAGGGGCTATGAACAGGA 50 3 117-157 27 syd1435 GGCAGCATAAGAGAAGCCAC AACCCCCTTTTCATGCTCTT 55 4 148-198 28 syd1470 CTCCATGTCCCTCTTTTCCA TGGGTTGAGTTTGTTTCTTGG 50 2 173-213 29 syd1652 CAATCATGGATTTGGGGAAC CGATCTCATTCACGCACTTT 50 1 132-172 30 Mchr5-163 CCAGTTTCCCTCCGTCAGTT TCGCTGTTCATCGTTGCTCT 55 5 171-211 注：标记 syd404和 Mchr5-163与绿豆抗豆象基因紧密连锁 DB 13/T 55242022 9 B B 附录B（规范性）DNA 提取及电泳相关试剂储备液 表B.1至表B.6给出了DNA 提取及电泳相关试剂储备液。表B.1 1.0mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸贮备液(Tris-HCl 贮备液)（pH8.0，1000 mL）成份 用量 备注 三羟甲基氨基甲烷(Tris 碱)121.1 g 超纯水（ddH2O）800 ml 加入 600 mLddH2O 加热搅拌 37%浓盐酸 42 mL 加约 42 ml 37%浓盐酸，调节 pH 值至 8.0 最终体积 1000 mL 用 ddH2O 定容至 1000 mL，高压灭菌保存 表B.2 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA缓冲液）（pH8.0，1000 mL）成份 用量 备注 乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA-2H2O）186.1 g ddH2O 700 mL 10 mol/L 氢氧化钠（NaOH）50 mL 用约 50 mL 10 mol/L 氢氧化钠调节pH 至 8.0 最终体积 1000 mL 用 ddH2O 定容至 1000 mL，高压灭菌保存 表B.3 2%十六烷基三甲基溴化铵 DNA提取液(2%CTABDNA提取液)（pH8.0，1000 mL）成份 用量 备注 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）20 g 氯化钠（NaCl）81.82 g 加入 600 mLddH2O 加热搅拌 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）100 mL 备注方法见表 B.1 0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）40 mL 备注方法见表 B.2 最终体积 1000 mL 用 ddH2O 定容至 1000 mL，高压灭菌保存 表B.4 1TE（500 mL）成份 用量 备注 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）5 mL 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 40%溶液（19：1）0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）1 mL ddH2O 484 mL 最终体积 500 mL 高压灭菌，4冰箱保存 DB 13/T 55242022 10 表B.5 8非变性聚丙烯酰胺凝胶（1000 mL）成份 用量 备注 40%非变性聚丙烯酰胺母液（19:1）200 mL 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 40%溶液（19：1）10TBE 缓冲液 100 mL ddH2O 700 mL 最终体积 1000 mL 过滤，4冰箱保存 表B.6 10倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液(10TBE 缓冲液)（pH8.0，1000 mL）成份 用量 备注 Tris 碱 20 g 硼酸 81.82 g 0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH=8.0）37.25 mL 配制方法同表 B.1 备注中描述方法 最终体积 1000 mL 用 ddH2O 定容至 1000 mL，高压灭菌保存