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DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准2 0 2 1-1 2-2 4 发 布 2 0 2 2-0 1-2 3 实 施D B 2 3/T 3 0 3 9 2 0 2 1黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布灵 芝 液 体 菌 种 制 备 技 术 规 程I C S 6 5.0 2 0.0 1C C S B 0 5D B 2 3/T 3 0 3 9 2 0 2 1I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 林 业 和 草 原 局 提 出。本 文 件 起 草 单 位：尚 志 市 远 成 菌 业 有 限 公 司、东 北 林 业 大 学、哈 尔 滨 学 院、黑 龙 江 省 尚 志 国 有 林 场管 理 局 老 街 基 林 场、黑 龙 江 省 尚 志 国 有 林 场 管 理 局、黑 龙 江 省 林 业 和 草 原 局 调 查 规 划 设 计 院。本 文 件 主 要 起 草 人：邹 莉、许 泽 成、孙 婷 婷、韩 金 胜、蔡 晓 楼、王 旭 彤、耿 楠 楠、孙 健、刘 传 龙、曲 晓 磊、李 亚 伟、乌 木 提 巴 合 提 别 克、佟 鑫 宇。D B 2 3/T 3 0 3 9 2 0 2 11灵 芝 液 体 菌 种 制 备 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 灵 芝（G a n o d e r m a l u c i d u m）液 体 菌 种 制 备 的 环 境 卫 生 要 求、生 产 仪 器 和 设 备、菌 种选 择、制 备 母 种、制 备 摇 瓶 液 体 种、液 体 种 发 酵 罐 空 消、制 备 发 酵 罐 液 体 种 培 养 基、发 酵 罐 液 体 种 的 接种、发 酵 罐 液 体 种 培 养 条 件、发 酵 罐 液 体 种 检 测、发 酵 罐 液 体 种 质 量 要 求、生 产 档 案。本 文 件 适 用 于 灵 芝 液 体 菌 种 制 备。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 1 5 0.1 压 力 容 器 第 1 部 分：通 用 要 求G B/T 1 9 2 1 工 业 蒸 汽 锅 炉 参 数 系 列G B 5 7 4 9 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准G B/T 1 1 1 6 5 实 验 室 p H 计G B/T 1 3 5 5 4 高 效 空 气 过 滤 器G B 1 9 1 5 3 容 积 式 空 气 压 缩 机 能 效 限 定 值 及 能 效 等 级G B 5 0 0 7 3 洁 净 厂 房 设 计 规 范N Y/T 5 2 8 食 用 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 环 境 卫 生 要 求4.1 生 产 环 境应 符 合 N Y/T 5 2 8 的 规 定。4.2 生 产 车 间应 符 合 G B 5 0 0 7 3 的 规 定。5 生 产 仪 器 和 设 备液 体 种 发 酵 罐 应 符 合 G B/T 1 5 0.1 的 规 定，空 气 压 缩 机 应 符 合 G B 1 9 1 5 3 的 规 定，空 气 过 滤 器 应 符 合G B/T 1 3 5 5 4 的 规 定，p H 计 应 符 合 G B/T 1 1 1 6 5 的 规 定，蒸 汽 锅 炉 应 符 合 G B/T 1 9 2 1 的 规 定，高 压 蒸 汽 灭菌 锅、超 净 工 作 台、恒 温 培 养 箱、恒 温 振 荡 培 养 箱、液 体 菌 种 接 种 枪、冰 箱、显 微 镜、磅 秤、天 平 应 符合 N Y/T 5 2 8 的 规 定。D B 2 3/T 3 0 3 9 2 0 2 126 菌 种 选 择选 择 抗 逆 性 强、抗 杂 菌 能 力 强、菌 丝 生 长 健 壮、产 量 高 的 菌 种。7 制 备 母 种7.1 母 种 培 养 基 的 制 作制 作 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基（P D A）或 综 合 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基（C P D A），装 入 试 管（1 8m m 1 8 0 m m 或 2 0 m m 2 0 0 m m）中，分 装 量 宜 为 试 管 长 度 的 1/4，塞 上 棉 塞，棉 塞 应 使 用 梳 棉。将 试 管 放 入 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 中，在 0.1 0 5 M p a 0.1 2 5 M p a 下 灭 菌 3 0 m i n。灭 菌 后 摆 放 成 的 斜 面 培 养 基顶 端 应 距 棉 塞 底 部 2 0 m m。7.2 接 种 与 培 养在 无 菌 条 件 下，用 接 种 钩 取 黄 豆 粒 大 小 的 初 始 菌 种 接 种 在 母 种 培 养 基 上。母 种 培 养 的 温 度 宜 为 2 8 1，空 气 相 对 湿 度 控 制 在 4 0%5 0%，通 风、避 光 培 养 1 4 d 1 8 d。8 制 备 摇 瓶 液 体 种8.1 培 养 基 配 方培 养 基 配 方：葡 萄 糖 2 0 g、玉 米 粉 1 0 g、酵 母 粉 5 g、蛋 白 胨 3 g、磷 酸 二 氢 钾 2 g、硫 酸 镁 1 g、水 1 0 0 0 m L。水 的 质 量 应 符 合 G B 5 7 4 9 的 规 定。8.2 培 养 基 的 制 作、灭 菌将 配 方 中 的 原 料 充 分 混 合 均 匀，装 入 5 0 0 m L 或 1 0 0 0 m L、耐 1 2 6 高 温、无 色 或 近 无 色 的 玻 璃 三 角瓶 中，装 液 量 宜 为 三 角 瓶 体 积 的 1/4，用 1 6 c m 1 6 c m 聚 乙 烯 透 气 封 瓶 膜 封 口。在 0.1 0 5 M p a 0.1 2 5M p a 下 灭 菌 3 0 m i n。8.3 摇 瓶 液 体 种 的 制 备在 无 菌 条 件 下，用 接 种 铲 将 一 管 母 种 接 入 摇 瓶 液 体 种 培 养 基 中，置 于 恒 温 振 荡 培 养 箱，在 2 8 以1 8 0 r/m i n 振 荡 培 养 9 d 1 2 d。当 培 养 液 澄 清 透 明，菌 丝 球 密 集 均 匀 悬 浮 于 液 体 中 不 分 层，即 可 获 得摇 瓶 液 体 种。9 液 体 种 发 酵 罐 空 消液 体 种 发 酵 罐 初 次 使 用，应 检 查 发 酵 罐 上 全 部 阀 门 和 压 力 表，进 行 空 消。空 消 时 罐 内 蒸 汽 压 力 应 达到 0.1 0 5 M p a 0.1 2 5 M p a、温 度 应 达 到 1 2 1 1 2 4 灭 菌 4 0 m i n。1 0 制 备 发 酵 罐 液 体 种 培 养 基1 0.1 培 养 基 配 方在 8.1 配 方 的 基 础 上 加 入 2.9 m L/L 的 消 泡 油。1 0.2 初 始 p H 值1 m o l/L H C l 或 1 m o l/L N a O H 调 节 p H 值 为 5.5 6.0。D B 2 3/T 3 0 3 9 2 0 2 131 0.3 投 料 与 定 容将 1 0.1 中 的 原 料 按 比 例 充 分 混 合 均 匀，倒 入 液 体 种 发 酵 罐 中，加 水 定 容 至 罐 体 总 容 积 的 6 5%7 0%，拧 紧 上 料 口 盖。1 0.4 灭 菌液 体 种 发 酵 罐 内 蒸 汽 压 力 应 达 到 0.1 0 5 M p a 0.1 2 5 M p a，温 度 应 达 到 1 2 1 1 2 4 灭 菌 4 0 m i n。1 0.5 冷 却灭 菌 后 将 冷 水 通 入 发 酵 罐 夹 层 或 者 内 置 冷 却 系 统 中 循 环，使 培 养 基 降 温 至 2 4 2 8。降 温 过 程中 应 及 时 向 发 酵 罐 内 通 入 无 菌 风。1 1 发 酵 罐 液 体 种 的 接 种用 带 有 手 柄 的 内 径 略 大 于 接 种 口 的 铁 丝 圈 缠 绕 纱 布，蘸 上 9 5%的 酒 精，套 在 接 种 口 上 点 燃。打 开 摇瓶 液 体 种 封 瓶 膜，用 火 焰 灼 烧 瓶 口 3 0 s 4 0 s，打 开 接 种 口 盖，将 摇 瓶 液 体 种 迅 速 倒 入 罐 中，接 种 量为 发 酵 罐 装 液 量 体 积 的 8%。迅 速 盖 好 接 种 口，拧 紧。1 2 发 酵 罐 液 体 种 培 养 条 件1 2.1 通 风 量每 分 钟 宜 通 入 无 菌 空 气 1.2 5 m3。1 2.2 罐 压应 保 持 在 0.0 3 M p a 0.0 5 M p a。1 2.3 培 养 温 度宜 控 制 在 2 8 1。1 2.4 培 养 时 间宜 控 制 在 8 d 1 0 d。1 3 发 酵 罐 液 体 种 检 测1 3.1 取 样接 种 4 d 后 进 行 检 测，用 酒 精 火 焰 灼 烧 取 样 阀 3 0 s 4 0 s，弃 掉 最 初 流 出 的 少 量 液 体 种，取 3 0 m L 5 0 m L 液 体 种 放 入 无 菌 1 5 0 m L 三 角 瓶 中，塞 紧 棉 塞。取 样 后 应 用 酒 精 火 焰 把 取 样 阀 烧 干。1 3.2 检 测对 1 3.1 所 取 样 品 在 P D A 平 板 培 养 基 上 画 线 培 养，在 2 8 1 下 培 养 2 d 3 d，每 天 观 察 菌 落 生长 情 况，若 P D A 平 板 培 养 基 上 灵 芝 菌 丝 正 常 生 长，没 有 杂 菌 污 染，则 表 明 菌 种 合 格。1 4 发 酵 罐 液 体 种 质 量 要 求1 4.1 感 官 指 标应 符 合 表 1 的 要 求。D B 2 3/T 3 0 3 9 2 0 2 14表 1 感 官 指 标项 目 指 标菌液色泽 球状菌丝体呈乳白色，滤液呈黄棕色菌液形态 菌液稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层菌液气味 有灵芝菌种培养时特有的香味，无异味，发酵罐排气口气味正常1 4.2 理 化 指 标应 符 合 表 2 的 要 求。表 2 理 化 指 标项 目 指 标p H 值 3.5 5.5菌丝湿重（g 1 0 0 m L）5显微镜下菌丝形态 菌丝粗壮，有球状和丛状菌丝，分布均匀样品无菌检查 有灵芝菌丝生长，无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长1 5 生 产 档 案应 建 立 生 产 档 案，内 容 包 括：环 境 卫 生 要 求、生 产 仪 器 和 设 备、菌 种 选 择、制 备 母 种、制 备 摇 瓶 液体 种、液 体 种 发 酵 罐 空 消、制 备 发 酵 罐 液 体 种 培 养 基、发 酵 罐 液 体 种 的 接 种、发 酵 罐 液 体 种 培 养 条 件、发 酵 罐 液 体 种 检 测、发 酵 罐 液 体 种 质 量 要 求。_
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