禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术DB35／T 1995-2021.pdf

ICS 11.220 CCS B 41 35 福建省地方标准 DB35/T 19952021 禽心包积 液-肝炎综 合征荧光 定量PCR 诊断技术 Fluorescence quantitative PCR diagnosis of fowl hydropercardium-hepatitis syndrome 2021-08-17 发布 2021-11-17 实施 福建省市 场监督 管 理局 发 布 DB35/T 19952021 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语 和定 义.1 4 疫病 概述.1 5 设备、材 料和 试剂.2 6 样品 的采 集、保存 和处理.2 7 样品 中病 毒DNA 提取.3 8 荧光 定量 PCR 操作 步骤.3 9 结果 判定.3 10 测序.4 附录A（规范 性）试剂 的配制 及引 物序 列.5 附录B（资料 性）扩增 产物参 考基 因序 列和 荧光 定量PCR 扩增 曲线 图.6 DB35/T 19952021 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责 任。本文件 由福建 省农 业科 学院 提 出。本文件 由福建 省农 业农 村厅 归 口。本文件 起草 单位：福 建省 农业科 学院 畜牧 兽医 研究 所、福 州海 关技术 中心。本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、万春和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。DB35/T 19952021 1 禽 心包积 液-肝炎综 合征荧 光定 量PCR 诊断技 术 1 范围 本文件 规定 了禽 心包 积液-肝炎综 合征 荧光 定量PCR 诊断 技 术的 设备、材料 和试剂，样 品的 采集、处理和保 存，样 品中 病毒DNA的提取，荧 光定 量PCR 操作步 骤 及 结果 判定 的技 术要 求。本文件 适用 于禽 心包 积液-肝炎综 合征 的分 子生 物学 诊断及 流行 病学 监测。2 规范性 引用 文件 本文件 没有 规范 性引 用文 件。3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 禽心包 积液-肝炎 综合 征 fowl hydropercardium-hepatitis syndrome；HHS 由禽腺 病毒4型引 起禽 类的以 心 包积 液、肝炎 为特 点的 一种 综合 征。3.2 禽腺病 毒4 型 fowl adenovirus serotype 4；FAdV-4 引起禽 心包 积液-肝炎 综合征 的 病原。3.3 循环阈 值 cycle threshold；Ct 值 荧光定 量PCR 反应 中每 个反应 管 内的 荧光 信号 达到 设定 的 阈值 时所 经历 的循 环数。4 疫病概 述 禽心包 积液-肝炎 综合 征（HHS），最 早 于1987 年 发生于巴基 斯坦 安卡 拉地 区。目前，该病 呈现 世界范围分 布，多个 国家、地 区相继 报道 该病 的发 生，各地分 离到 的毒 株略 有差 异，但大 多为FAdV-4，且 具有很强 的致病 性。2010年以 来，我国多 地发 生了HHS，并从 发病鸡 群中 分离到FAdV-4。该病 主要 临床特征为心包 充盈，心 包内 积 有淡黄 色液 体或 胶冻 样物；肝 脏呈 现不 同程 度肿 胀，质 地较 脆、易碎，有出血斑或出 血点；肾 脏肿 大、质地较 脆，有的 呈现“花斑 肾”。该病 主要 发生 于3 5周龄 肉鸡，10 20 周龄蛋鸡偶 有 发生，有 报道 鸭、鹅、鸽及 野鸟 也可 发生 该病。发 病鸡 在4 d 后开 始 死亡，死亡 期可 持续7 d 10 d，发病 率和 病死 率分别 为10%30%和20%75%。该 病一 年 四季 均可 发生，以 水平 传 播为 主，也可垂直传播，感 染鸡 排毒 期可 长达9 周，发 病日 龄越 早，死 淘 率越 高。DB35/T 19952021 2 5 设备、材料 和试 剂 设备 5.1 5.1.1 台式冷 冻高 速离 心机（转 速应12 000 r/min）。5.1.2 水浴锅 或金 属浴。5.1.3 微量可 调移 液器（量 程分别 为 100 L1 000 L、20 L200 L、2 L 20 L、0.5 L10 L）。5.1.4 荧光定 量PCR 仪。5.1.5 旋涡混 合仪 材料和 试剂 5.2 5.2.1 棉拭子 稀释 液：配比 按照 附录A 的A.1。5.2.2 组织稀 释液：配比 按照 附录 A 的A.2。5.2.3 10%SDS 溶液：配比 按照 附录A 的A.3。5.2.4 3 mol/L 醋酸 钠缓 冲液（pH5.2）：配比 按照 附录 A 的 A.4。5.2.5 75%乙醇：配比 按照 附录A 的A.5。5.2.6 荧光定 量PCR 检测 用引 物和 探 针的 序列、使用 方法：配比 按照 附录 A 的 A.6。5.2.7 蛋 白酶 K、Tris 饱和 苯酚、酚:氯仿:异戊 醇（25:24:1）、无水 乙醇：直 接购 买成品 使用。5.2.8 Probe qPCR 试剂 盒：应 与荧 光 定量 PCR 仪相 配套 的 探针 qPCR 试剂 盒。5.2.9 PCR 反应 管：与荧 光定 量PCR 仪相 配套 的 PCR 反 应管。5.2.10 阳性对照：含FAdV-4 目的基 因 片段 的质粒 DNA（拷贝 数 2.13104/L）。5.2.11 阴性对 照：Nuclease-free Water。6 样品的 采集、保 存和 处理 样品的 采集 6.1 6.1.1 棉拭子 样品 的采 样 将棉拭 子插 入咽 喉或 泄殖 腔旋转35 次，取 出放 入盛有1.0 mL棉拭 子稀 释液 的1.5 mL 无 菌离 心管 中。6.1.2 组织样 品的 采集 无菌采 集病 禽有 明显 病变 的肝脏、脾 脏等 组织。样品保 存 6.2 样品采 集后应 保存 在2 8 条件下，24 h内送 达实验 室。超 过24 h的应 保存在-20 条 件下，且时间 不应 超过7 d。如 需 长期保 存，须保 存在-70-80 条件 下。样品的 处理 6.3 6.3.1 棉拭子 样品 的处理 取出棉 拭子 样品，于 旋涡 混合仪 上振 荡15 s，4、5 000 r/min 离心10 min，取上 清液 备用。DB35/T 19952021 3 6.3.2 组织样 品的 处理 取组织 样品，按质 量体积 比（1:5）加 入组织 稀释 液 进行匀 浆，转 入1.5 mL无 菌离心 管中，反复 冻融23 次 后，4、5 000 r/min 离心10 min，取上 清液备 用。7 样 品 中病毒 DNA 提取 常规方法 提取 DNA 7.1 7.1.1 取 540 L 上 清液，先加 60 L 10%SDS 溶液 后，再加蛋 白酶 K 至终 浓度 50 g/mL，于 旋涡混合 仪 上混匀 15 s，置 56 孵育 2 h。7.1.2 加 入 等体积 Tris 饱和 苯酚，于 旋涡 混合 仪上 混匀 15 s 后，置 4、12 000 r/min 离心 15 min。7.1.3 离心后 吸取上 清液 转移 至 1.5 mL 无菌 离心 管（注 意 不要吸 出中间 层），加入 等体积 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），颠倒混 匀 15 s，静置 5 min 后，置 4、12 000 r/min 离心 15 min，吸 取上 清液转至 其他 无菌 离 心管 中。7.1.4 重复7.1.3 步骤 1 次。7.1.5 加入相 当于 上清 液 1/10 体积 的 3 mol/L 的 醋酸 钠缓 冲液（pH5.2）、2 倍体 积的 无 水乙 醇，颠倒 混匀 15 s，-20 沉淀2 h。7.1.6 于4 下 12 000 r/min 离心 15 min 后倾去 上清 液，加 入 800 L 75%乙醇 溶解 沉淀物，置4 下 12 000 r/min 离心 5 min 后吸尽 残余 液体；再 以75%乙醇 溶解 沉淀 物 1 次，置 4 下 12 000 r/min离心5 min，吸 尽残 余液 体；置4 下12 000 r/min 离心 5 s 后吸 尽残 余液体，室温 静置 5 min。7.1.7 加入50 L 灭 菌双 蒸水 溶 解沉淀 物，冰 浴备 用。提取 的 DNA 应于 2 h 内进 行荧 光 定量 PCR 或保存于-20 条件 下。商品化 试剂 盒提 取DNA 7.2 病毒DNA 的提 取，也可 采用商 品 化DNA 提 取试 剂盒 提取。8 荧光定量 PCR 操作 步骤 在PCR 反应 管中分 别加入 以下试剂：Probe qPCR mix 10 L，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4 L，探针引物FAdV-4-P 0.8 L，模板DNA 2.0 L，加Nuclease-free Water至总 体积20 L，混 匀，离心5 s。将PCR 反 应管 放入 定量PCR 仪，扩 增反 应条 件：95 预变性2 min；95 变性10 s，60 退火30 s，共40个 循环；最 后保 存于4。同时，设立 阳性 对照 和阴性 对照 各至 少一 个。9 结果判 定 阳性对 照有典 型的 扩增 曲线，且Ct值 27；阴性 对照 无 扩增 曲线，且无Ct值；两 者均 符合，方可判定检测 结果 有效，见 附录B 的B.1。待检样品Ct 值32时，且出 现 典型 的扩 增曲 线，判为FAdV-4核酸 检测 阳性，见 附录B的B.1。待检样品Ct 值35时，或 无典型 的扩 增曲 线，判为FAdV-4 核酸 检测 阴性，见 附录B的B.1。待检样品32Ct值 35时 判为可疑，应 重做；重做 时待检 样品Ct 值32 判为FAdV-4 核酸检 测阳 性，待检样品Ct 值32判为FAdV-4核酸 检测 阴性。DB35/T 19952021 4 10 测序 必要时 可对 定量PCR 产 物进行 测 序，参考 序列 参见 附录B的B.2。DB35/T 19952021 5 附录A（规范 性）试剂的 配制 及引 物序 列 A.1 棉拭子 稀释 液 0.01 mol/L PBS 缓冲 液中 添加 青 霉素（10 000 IU/mL）、链 霉 素（10 mg/mL）、庆 大 霉 素（250 pg/mL）和制霉 菌素（5 000 IU/mL），调 节pH 至7.2 7.4。A.2 组织稀 释液 0.01 mol/L PBS 缓冲 液中添 加青霉 素（2 000 IU/mL）、链霉 素（2 mg/mL）、庆大 霉 素（50 pg/mL）和制霉 菌素（1 000 IU/mL），调 节pH 至7.2 7.4。A.3 10%SDS 溶液 称量10 g 十 二烷 基硫 酸钠，加入90 mL灭菌 双蒸 水，小 心 搅拌，缓 慢加 热至 水温 在25 以 上使 之完全溶解。A.4 3 mol/L 的醋 酸钠 缓冲 溶液 取800 mL水 加入408 g三水醋 酸 钠，溶解 后用冰 乙酸 调节pH 值至5.2，加水 定容到1 000 mL。A.5 75%乙醇 量取750 mL 的 无水 乙醇 加入250 mL的灭 菌双 蒸水。A.6 荧光定 量 PCR 检测 用引 物序 列 荧光定 量PCR 检测 用引 物序列 为：a)正向引 物 FAdV-4-F：5-CCCGATCTCAGTCAAATT-3；b)反向引 物 FAdV-4-R：5-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3；c)探针引 物 FAdV-4-P：5-FAM-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3。荧光定 量PCR 扩增 片段 为196 bp，引 物和 探针 用双 蒸水 溶 解至10 mol/L，保 存于-20 备用。DB35/T 19952021 6 附录B（资料 性）荧光定 量PCR 扩 增曲 线图 和扩增 产物 参考 基因 序列 B.1 荧光定 量PCR 扩增 曲线 图 以建立 的荧光 定量PCR 诊断技 术 对2 份阳 性样品 和2份 阴性样 品进行 检测，同时 设阳性 对照和 阴性 对照，结 果见 图B.1。标引序号说明：I-阳性对照；N-阴性对照；2-阳性样品；3-阳性样品；4-阴性样品；5-阴性样品。图B.1 荧光定 量PCR 扩增 曲线 图 B.2 扩增产 物参 考基 因序 列 选择FAdV-4 GDMZ 株（GenBank 的登录号：MG856954）Hexon 基因序列作为参考基因序列：cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactaccaacttctacttcggcacggtaccctcctacgaaatcgatatcagcgctacccagaggcgcaactttatcatggccaacatcgccgagtatctgcccgaccgttacaagtttagc。