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I C S 6 5.0 2 0.0 1C C S B 1 5DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 1绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 抗 性 鉴 定 技 术 规 程C o d e o f p r a c t i c e f o r e v a l u t a i o n o f r e s i s t a n c e t o l e a f s p o t c a u s e d b y c e r c o s p o r ac a n e s c e n s i n m u n g b e a n2 0 2 1-1 2-2 3 发 布 2 0 2 2-0 2-2 3 实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 1I目 次前 言.引 言.1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.13.1 绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病.14 接 种 体 制 备.24.1 病 原 菌 的 分 离 及 鉴 定.24.2 致 病 性 测 定.24.3 病 原 菌 的 繁 殖 和 保 存.25 鉴 定 材 料 准 备.25.1 种 子 选 择.25.2 鉴 定 材 料 种 植.26 接 种.26.1 接 种 体 制 备.26.2 接 种 叶 片.26.3 接 种 方 法.37 病 情 调 查.37.1 调 查 时 间.37.2 病 情 分 级.38 抗 病 性 评 价.38.1 鉴 定 有 效 性 判 别.38.2 抗 病 性 评 价 标 准.3附 录 A（资 料 性）培 养 基 制 备 方 法.4附 录 B（规 范 性）鉴 定 记 载 表 格.5D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 1I I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 与 起 草 规 则 的 规定 起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 科 学 院 粮 食 作 物 研 究 所 提 出。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 提 出 并 归 口 管 理。本 文 件 起 草 单 位：湖 北 省 农 业 科 学 院 粮 食 作 物 研 究 所、湖 北 省 农 业 科 学 院 植 保 土 肥 研 究 所、十 堰 市农 业 科 学 院。本 文 件 主 要 起 草 人：刘 昌 燕、万 正 煌、焦 春 海、李 莉、黄 薇、张 凡、陈 宏 伟、刘 良 军、韩 雪 松、彭宣 和。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问，可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅，联 系 电 话：0 2 7-8 7 6 6 5 8 2 1，邮 箱：h b s n a b 1 2 6.c o m。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 湖 北 省 农 业 科 学 院 粮 食 作 物 研 究 所，联 系 电 话：0 2 7-8 7 3 8 9 6 1 1，邮 箱：L i u c y 0 6 0 2 1 6 3.c o m。D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 1V引 言绿 豆（V i g n a r a d i a t a(L i n n.)W i l c z e k）具 有 极 强 的 生 产 适 应 性、独 特 的 营 养 价 值、良 好 的 保 健 功 效、有 效 的 固 氮 养 地 功 能，已 成 为 湖 北 省 的 特 色 产 业，在 保 障 农 民 增 收 致 富、改 善 广 大 居 民 膳 食 结 构、促 进农 业 可 持 续 发 展、保 护 农 业 多 样 性 等 方 面 起 到 了 非 常 重 要 的 作 用。由 变 灰 尾 孢（c e r c o s p o r a c a n e s c e n s）引 起 的 绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 是 绿 豆 生 产 上 的 重 要 病 害，轻 者 减 产 2 0 5 0%，严 重 的 高 达 9 0%以 上。培 育 抗 病品 种 是 控 制 该 病 最 有 效 的 方 法 之 一，而 建 立 快 速 简 便 的 抗 性 鉴 定 体 系 是 进 行 绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 抗 病 育 种的 关 键。为 此，我 们 通 过 多 年 的 试 验 研 究，制 定 出 本 文 件，可 有 效 克 服 绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 抗 病 性 鉴 定 难题，为 绿 豆 抗 病 资 源 筛 选 和 抗 病 品 种 的 选 育 提 供 技 术 支 持。D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 11绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 抗 性 鉴 定 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 接 种 体 准 备、鉴 定 材 料 准 备、接 种、病 情 调 查 和 抗 病 性 评 价。本 文 件 适 用 于 绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 室 内 离 体 叶 片 人 工 接 种 鉴 定 及 评 价。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 4 4 0 4.2 粮 食 作 物 种 子 第 2 部 分：豆 类3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1绿 豆 尾 孢 菌 叶 斑 病 c e r c o s p o r a l e a f s p o t由 变 灰 尾 孢（C e r c os por a c ane s c e ns）所 产 生 的 叶 部 症 状 的 病 害。4 接 种 体 准 备4.1 病 原 菌 的 分 离 及 鉴 定将 从 田 间 采 集 的 发 病 叶 片 用 无 菌 水 冲 洗 干 净，从 病 健 交 界 处 切 取 3 m m 3 m m 小 块 组 织；用 7 5%乙 醇 溶液 浸 泡 2 s 3 s,再 用 1%次 氯 酸 钠 消 毒 3 m i n,后 用 灭 菌 水 冲 洗 3 次,用 无 菌 吸 水 纸 吸 干,然 后 接 种 到 V 8 培 养基 上,在 2 8 条 件 下 培 养；待 菌 丝 长 出 后 转 入 V 8 培 养 基 进 一 步 纯 化，并 于 4 低 温 下 保 存 备 用。4.2 致 病 性 测 定将 分 离 物 回 接 绿 豆 叶 片 进 行 致 病 性 测 定，致 病 性 测 定 采 用 离 体 叶 片 菌 丝 块 接 种 法。4.3 病 原 菌 的 繁 殖 和 保 存接 种 所 用 分 离 物 应 采 用 强 致 病 力 菌 株。在 接 种 前 需 要 进 行 病 原 物 接 种 体 的 繁 殖，常 用 培 养 基 为 V 8培 养 基，在 2 8 恒 温 培 养 箱，待 菌 丝 布 满 整 个 平 板，菌 株 斜 面 保 存 于 4 冰 箱 中。4.4 接 种 体 的 制 备将 保 种 的 分 离 物 在 V 8 培 养 基（见 附 录 A）上 于 2 8 恒 温 培 养 箱 中 活 化 培 养，待 菌 丝 长 满 平 板 后，再 用 无 菌 的、直 径 6 m m 的 打 孔 器 在 活 化 好 的 菌 株 菌 落 生 长 边 缘 打 孔，将 菌 丝 面 朝 下 接 种 在 V 8 培 养 基 中D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 12进 行 扩 大 繁 殖，以 备 接 种。5 鉴 定 材 料 准 备5.1 种 子 选 择取 颗 粒 饱 满，大 小 相 近 的 绿 豆 种 子 进 行 表 面 消 毒，用 7 5%乙 醇 消 毒 2 0 s，1%次 氯 酸 钠 消 毒 3 m i n，最后 用 无 菌 水 洗 3 次；表 面 消 毒 后 的 种 子 放 在 2 3 层 喷 有 水 的 吸 水 纸 上 备 用，取 已 知 的 感 病 品 种 作 为 对 照。豆 类 种 子 质 量 应 满 足 G B 4 4 0 4.2 的 要 求。5.2 种 子 处 理将 培 养 土 高 温 高 压 灭 菌 后，分 装 到 培 养 盘 内,整 平,压 实 苗 床,控 制 土 壤 相 对 含 水 量 约 7 0%8 0%,表面 消 毒 后 的 种 子 点 播 到 培 养 盘 内，用 细 土 层 覆 盖 种 子；2 5 1 2 h 光 照/1 2 h 黑 暗 交 替 培 养，定 期 观 察 绿 豆苗 生 长 情 况，适 时 浇 水。6 接 种6.1 接 种 时 期接 种 时 期 为 第 一 对 单 叶 平 展，采 集 复 叶 叶 片，清 水 洗 净 后 放 在 塑 料 盒 内 湿 润 的 吸 水 纸 上,叶 片 的 正面 向 上。6.2 接 种 方 法在 接 种 叶 片 中 部 稍 偏 叶 脉 部 位 用 灭 菌 牙 签 扎 一 小 伤 口,取 菌 饼 将 菌 丝 面 朝 下 接 种 到 绿 豆 叶 片 伤 口 之上，接 种 后，塑 料 盒 用 保 鲜 膜 封 紧 保 湿，放 入 温 室 2 5 条 件 下 培 养 并 与 吸 水 纸 放 入 盒 中 保 持 湿 润，1 2 h光 照/1 2 h 黑 暗 交 替 培 养，一 个 品 种 4 个 重 复，每 个 重 复 1 0 片 叶 子。7 病 情 调 查7.1 调 查 时 间接 种 后 第 7 d 进 行 调 查。7.2 病 情 分 级测 量 叶 片 病 斑 大 小，根 据 病 斑 大 小 平 均 值，进 行 分 级，按 照 附 录 B 的 表 格 进 行 记 载，划 分 标 准 见 表 1。表 1 绿 豆 抗 尾 孢 菌 叶 斑 病 鉴 定 病 情 级 别 划 分病情级别 病斑描述0 无可见侵染病斑1 叶片上仅有小点状病斑，直径2 m m 以下2 病斑直径3 m m 以下，边缘褐色3 直径3 m m 6 m m 以上的中型斑，边缘褐色，中央有灰白色坏死组织4 直径6 m m 以上的不规则型病斑D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 138 抗 病 性 评 价8.1 鉴 定 有 效 性 判 别当 设 置 的 感 病 或 高 感 对 照 材 料 达 到 病 情 级 别 3 或 者 4 级，该 批 次 抗 叶 斑 病 鉴 定 视 为 有 效。参 鉴 材 料 中初 次 鉴 定 表 现 为 抗 病 的 品 种 需 进 行 重 复 鉴 定，以 进 一 步 确 定 其 抗 性 及 稳 定 性。8.2 抗 病 性 评 价 标 准依 据 鉴 定 材 料 发 病 程 度（病 情 级 别）确 定 其 抗 性 水 平，划 分 标 准 见 表 2。表 2 绿 豆 对 尾 孢 菌 叶 斑 病 抗 性 的 评 价 标 准病情级别 抗性0 高抗 H i g h r e s i s t a n c e(H R)1 抗 R e s i s t a n c e(R)2 中抗 M o d e r a t e r e s i s t a n c e（M R）3 感 S u s c e p t i b i l i t y(S)4 高感 H i g h S u s c e p t i b i l i t y(H S)D B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 14A A附 录 A（资 料 性）培 养 基 制 备 方 法表 A.1 给 出 了 V 8 培 养 基。表 A.1 V 8 培 养 基 制 备 方 法培养基名称 配方 灭菌条件V 8 培养基V 8 果汁2 0 0 m l，C a C O33.0 g，琼脂糖1 5 g，蒸馏水定容至1 L,p H 为 7.2.1 2 1 灭菌1 5 m i nD B 4 2/T 1 7 8 0 2 0 2 15B B附 录 B（规 范 性）鉴 定 记 载 表 格表 B.1 规 定 了 鉴 定 记 载 表 格。表 B.1 鉴 定 记 载 表 格编号 重复数 病斑直径（m m）平均值（m m）病情级别 抗性水平品种名1重复1重复2重复3品种名 2重复 1重复 2重复3品种名3重复1重复2重复3品种名 4重复 1重复 2重复3记 录 人：日 期：_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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