绿孔雀检疫技术 第2部分：禽流感病毒实验室检测技术规范DB53／T 1064.2-2021.pdf

I C S 1 1.2 2 0C C S B 4 153云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 1绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 2 部 分：禽 流 感 病 毒实 验 室 检 测 技 术 规 范Q u a r a n t i n e t e c h n i q u e f o r P a v o m u t i c u s P a r t 2:T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n s f o r l a b o r a t o r y e x a m i n a t i o n o fA v i a n I n f l u e n z a V i r u s2 0 2 1-0 9-3 0 发 布 2 0 2 1-1 0-1 4 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 1I目 次前 言.I I I引 言.1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 缩 略 语.25 总 则.26 禽 流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型.27 仪 器 设 备 和 试 剂.37.1 实 验 室 器 材.37.2 试 剂.38 样 品.38.1 采 样 要 求 与 原 则.38.2 采 样 类 型 和 采 样 方 法.38.3 样 品 储 运.49 试 验 步 骤.49.1 样 品 制 备.49.2 鸡 胚 接 种.49.3 M D C K 细 胞 培 养.49.4 病 毒 血 凝（H A）试 验 和 血 凝 抑 制（H I）试 验.59.5 逆 转 录-聚 合 酶 链 式 反 应（R T-P C R）扩 增 检 测.59.6 H 蛋 白 序 列 分 析.71 0 试 验 数 据 处 理.71 0.1 H A 试 验 结 果 判 定.71 0.2 H I 试 验 结 果 判 定.71 0.3 核 酸 检 测 结 果 判 定.8附 录 A（规 范 性）缓 冲 溶 液 和 1%鸡 红 细 胞 悬 液.9附 录 B（资 料 性）采 样 记 录 表.1 0D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 1I I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。本 文 件 是 D B 5 3/T 1 0 6 4 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 2 部 分。D B 5 3/T 1 0 6 4 已 经 发 布 了 以 下 部 分：第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 3 部 分：羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局、云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 2）归 口。本 文 件 主 要 起 草 单 位：云 南 农 业 大 学、云 南 省 标 准 化 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：陈 培 富、黄 艳 梅、卓 娜、李 建 春、胡 世 享、杨 俊、钱 丽 敏、何 依 蓉、邹 丰 才、杨 建 发。D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 1引 言绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）在 我 国 仅 分 布 于 云 南，是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物，也 是 全 球 濒 危 物 种，并 已 列 入 濒 危 野 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约(C I T E S)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录。为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法，编 制 并 发 布 D B 5 3/T 1 0 6 4 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准，可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相 关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断，从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施，以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率，维 护 绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效。本 文 件 已 发 布4 个 部 分：第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、仪器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范；第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、禽流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范；第 3 部 分：羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理、试 验 条 件、仪 器 设 备和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范；第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理、常 见 线 虫 形 态 特 征、试 验 条 件、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范。D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 11绿 孔 雀 检 疫 技 术第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示：由 于 禽 流 感 病 毒 可 感 染 人 类，采 样 和 检 测 人 员 应 穿 戴 防 护 服 及 口 罩，并 采 取 必 要 的 消 毒措 施。涉 及 禽 流 感 病 毒 的 实 验 操 作，应 在 相 应 的 生 物 安 全 级 别 实 验 室（符 合 G B 1 9 4 8 9 的 要 求）进 行。本检 测 技 术 规 范 中 凡 接 触 病 毒 样 品 的 检 验 器 材、废 弃 物 及 其 包 装 物 均 应 做 消 毒 或 灭 菌 等 无 害 化 处 理，以 免污 染 环 境 或 扩 散 病 毒。1 范 围本 文 件 规 定 了 绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）检 疫 技 术 中 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、禽 流 感 病 毒毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，标 注 日 期 的 引 用 文件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 标 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适用 于 本 文 件。G B 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求N Y/T 5 4 1 兽 医 诊 断 样 品 采 集、保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1禽 流 感 a v i a n i n f l u e n z a禽 流 感 是 由 正 粘 病 毒 科（O r t h o m y x o v i r i d a e）甲 型 流 感 病 毒 属（I n f l u e n z a v i r u s A）成 员 引 起 禽 类 的 一种 急 性、全 身 出 血 性 传 染 病。3.2病 毒 血 凝 v i r a l h e m a g g l u t i n a t i o n具 有 血 凝 活 性 的 病 毒（如 流 感 病 毒）粒 子，凭 借 其 表 面 的 血 凝 素 识 别、结 合 特 定 动 物 红 细 胞 表 面 受体 并 使 红 细 胞 凝 集（即 红 细 胞 不 再 自 然 下 沉 汇 集）。3.3病 毒 血 凝 抑 制 v i r a l h e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i o n抗 体 特 异 性 结 合 于 具 有 血 凝 活 性 的 病 毒 粒 子 的 血 凝 素（H）抗 原 位 点，干 扰 病 毒 H 蛋 白 与 红 细 胞 受体 之 间 的 结 合，从 而 阻 断 或 抑 制 病 毒 粒 子 凝 集 红 细 胞 的 能 力。3.4反 转 录-聚 合 酶 链 式 反 应 r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n-p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o nD B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 12以 R N A（m R N A）为 模 板，经 逆 转 录 酶 催 化 生 成 c D N A，再 以 c D N A 为 模 板 进 行 聚 合 酶 链 式 反 应（P C R）扩 增，常 用 于 获 得 目 的 基 因 或 检 测 m R N A 表 达。3.5弗 林 蛋 白 f u r i n亦 称 作 成 对 碱 性 氨 基 酸 裂 解 酶，是 动 物 细 胞 产 生 的 内 切 蛋 白 酶，能 识 别、裂 解 流 感 病 毒 血 凝 素（H）蛋 白 中 存 在 的 R-X-X-R位 点，产 生 H 1 和 H 2 两 个 亚 基，以 形 成 具 有 感 染 活 性 的 流 感 病 毒 粒 子。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。A I V：禽 流 感 病 毒 A v i a n i n f l u e n z a v i r u sA M V：禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 A v i a n m y e l o b l a s t o s i s v i r u sD E P C：焦 碳 酸 二 乙 酯 D i e t h y p y r o c a r b o n a t ed N T P：脱 氧 核 苷 酸 D e o x y r i b o n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t eH：血 凝 素 H e m a g g l u t i n i nH A：血 凝 H e m a g g l u t i n a t i o nH A U：血 凝 单 位 H e m a g g l u t i n a t i o n u n i tH E P E S：4-羟 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸 4-(2-h y d r o x y e t h y l)-1-p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i c a c i dH I：血 凝 抑 制 H e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i o nH P A I：高 致 病 性 禽 流 感 H i g h l y p a t h o g e n i c a v i a n i n f l u e n z aM：基 质 蛋 白 M a t r i x p r o t e i nM D C K：犬 肾 传 代 细 胞 M a d i n-D a r b y k i d n e y c e l l sN：神 经 氨 酸 酶 N e u r a m i n i d a s eP B S：磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 P h o s p h a t e-b u f f e r e d s a l i n eP C R：聚 合 酶 链 式 反 应 P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o nR B C s：红 细 胞 R e d b l o o d c e l l sR N A：核 糖 核 酸 R i b o n u c l e i c a c i dR T-P C R：反 转 录-聚 合 酶 链 式 反 应 R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n-p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o nS P F：无 特 定 病 原 体 S p e c i f i c p a t h o g e n f r e e5 总 则5.1 鸡 胚 接 种 和 M D C K 细 胞 培 养 均 是 分 离 禽 流 感 病 毒 的 有 效 方 法，检 测 流 感 病 毒 时，根 据 具 体 情 况 选用 其 一，或 同 时 采 用。5.2 取 5.1 收 获 的 尿 囊 液 或 M D C K 细 胞 培 养 物 上 清 做 H A 试 验 和 H I 试 验，确 定 分 离 毒 株 的 种 属 及 血 清 型（亚 型）。5.3 对 5.1 或 5.2 分 离 毒 株 采 用 R T-P C R 扩 增 分 析 其 M 基 因，做 出 禽 流 感 病 毒 定 性 鉴 定。5.4 对 5.2 确 定 的 禽 流 感 病 毒 H 5、H 7 或 H 9 血 清 亚 型 的 分 离 毒 株，用 血 清 亚 型 特 异 性 引 物 做 R T-P C R 扩 增检 测 其 H 基 因，并 依 据 H 基 因 测 序 结 果 判 定 分 离 毒 株 的 致 病 性 程 度。6 禽 流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 13根 据 禽 流 感 病 毒 致 病 性 或 毒 力 的 不 同，可 以 将 禽 流 感 分 为 高 致 病 性 禽 流 感、低 致 病 性 禽 流 感 和 无 致病 性 禽 流 感。已 知 流 感 病 毒 可 分 为 1 8 个 H 亚 型 和 1 1 个 N 亚 型。其 中，由 H 5 和 H 7 亚 型 毒 株（以 H 5 N 1 和 H 7 N 7为 代 表）引 起 的 禽 流 感 通 常 为 H P A I，其 传 染 性 强，死 亡 率 高、危 害 大。7 仪 器 设 备 和 试 剂7.1 实 验 室 器 材P C R 仪、凝 胶 成 像 系 统、台 式 低 温 高 速 离 心 机、电 泳 仪、电 泳 槽、冰 箱、微 量 移 液 器、水 浴 锅、照胶 仪、手 术 器 械、棉 拭 子、离 心 管、抗 凝 管、一 次 性 滤 器（滤 膜 孔 径 0.4 5 m）、细 胞 培 养 瓶、V 形 孔 血凝 反 应 板、微 型 振 荡 器 等。7.2 试 剂R N A 提 取 试 剂 或 试 剂 盒、氯 仿、异 丙 醇、7 5%乙 醇、1.0%琼 脂 糖 凝 胶、阿 氏 液（A l s e v e r s s o l u t i o n）（见 附 录 A.1）、1%鸡 红 细 胞 悬 液（见 附 录 A.2）、0.0 1 m o l/L P B S（p H 7.2）、核 酸 染 料、标 准 禽 流感 病 毒 抗 原 与 参 考 毒 株、阳 性 对 照 血 清、阴 性 对 照 血 清、M D C K 细 胞、D M E M 培 养 基、青 霉 素、链霉 素、H E P E S、胰 蛋 白 酶、引 物、1 0 扩 增 反 应 缓 冲 液、d N T P s（每 种 核 苷 酸 2.5 m m o l/L）、琼 脂 糖、核 酸 上 样 缓 冲 液、胶 回 收 试 剂 盒 等。8 样 品8.1 采 样 要 求 与 原 则8.1.1 采 样 要 求采 样 应 符 合 N Y/T 5 4 1 的 要 求。8.1.2 采 样 原 则采 集 的 样 品 应 具 有 典 型 性，从 濒 死、死 亡 或 处 于 急 性 发 病 期 的 绿 孔 雀 采 集 样 品，对 暴 发 疫 病 的 群 体宜 采 集 多 只 发 病 或 死 亡 绿 孔 雀 的 样 品。采 样 过 程 应 无 菌 操 作，装 样 品 的 容 器 应 确 保 密 封 完 好，注 意 避 免被 污 染 以 及 污 染 环 境，并 及 时 填 写 采 样 记 录 表（见 附 录 B），确 保 样 品 编 号 与 标 签 一 致。8.2 采 样 类 型 和 采 样 方 法8.2.1 口 咽 拭 子 和 泄 殖 腔 拭 子采 样 方 法 如 下：a)取 咽 喉 拭 子 时，将 拭 子 深 入 孔 雀 喉 头 口 及 上 颚 裂 来 回 刮 3 次 5 次 取 咽 喉 分 泌 液；b)取 泄 殖 腔 拭 子 时，将 拭 子 深 入 孔 雀 泄 殖 腔 转 一 圈 并 沾 取 少 量 内 容 物；c)同 一 个 体 的 咽 喉 拭 子 和 泄 殖 腔 拭 子 合 并 放 入 预 先 盛 有 1.0 m L P B S（含 1 0 0 I U/m L 青 霉 素 和 1 0 0 g/m L 链 霉 素）的 离 心 管 中，盖 紧 管 盖，并 对 样 品 编 号。8.2.2 组 织 样 品若 绿 孔 雀 死 亡 在 2 4 h 以 内，则 适 合 采 集 组 织 样 品。每 只 绿 孔 雀 采 集 肺（或 气 管）、脑、心、肝、脾、胃、肾 等 组 织 各 1 份，数 量 均 宜 不 少 于 3 g。待 检 样 品 装 入 一 次 性 密 封 袋 或 其 它 灭 菌 容 器，确 保 密封 完 好，编 号，送 实 验 室。D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 148.2.1 血 清每 只 孔 雀 采 集 静 脉 血 2 m L 3 m L，盛 于 无 菌 器 皿 中 或 1 0 m L 离 心 管 中，3 7 静 置 1 h 或 4 静置 3 h 4 h，经 2 0 0 0 r/m i n 3 0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n 分 离 血 清，将 血 清 移、分 装 于 新 的 无 菌 离 心 管，盖紧，封 好 管 口，贴 上 标 签。刚 死 亡 的 绿 孔 雀 可 用 无 菌 注 射 器 从 其 心 脏 采 血，直 接 转 移 至 无 菌 离 心 管 中，密 封，编 号，同 法 分 离血 清。8.3 样 品 储 运8.3.1 口 咽 及 泄 殖 腔 拭 子拭 子 样 品 在 4 条 件 下 保 存 不 应 超 过 2 4 h，若 长 期 保 存，应 置 于 8 0 冰 箱。8.3.2 组 织 样 品组 织 样 品 应 冰 冻（2 0 以 下）保 存 和 运 输，且 不 能 反 复 冻 融。8.3.3 血 清一 周 内 做 检 查 的 血 清 可 置 4 冰 箱 保 存。若 长 时 间 保 存，应 将 血 清 放 入 2 0 或 8 0 冰 箱 冻 存。9 试 验 步 骤9.1 样 品 制 备9.1.1 口 咽 及 泄 殖 腔 拭 子用 经 灭 菌 的 镊 子 将 拭 子 中 的 液 体 充 分 挤 出，混 匀 样 品，直 至 拭 子 上 没 有 肉 眼 可 见 的 样 品，室 温 放 置3 0 m i n，4 3 0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n，转 移 上 清 液 于 1.5 m L 无 菌 离 心 管 内，编 号 备 用。9.1.2 组 织 样 品取 适 量 待 检 样 品 置 于 洁 净、灭 菌 并 烘 干 的 研 钵 中，加 入 液 氮 充 分 研 磨。按 1 g 组 织 样 品 加 1 0 m L P B S的 比 例 混 匀，4 3 0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n，取 上 清 液 转 入 1.5 m L 无 菌 离 心 管 内，编 号，备 用。9.2 鸡 胚 接 种9.2.1 样 品 处 理取 9.1 得 到 的 上 清 液 过 滤，滤 过 液 作 为 接 种 材 料。9.2.2 样 品 接 种取 9.2.1 样 品，以 0.2 m L/胚 剂 量 经 尿 囊 腔 途 径 接 种 9 d 1 1 d S P F 鸡 胚，每 个 样 品 接 种 3 5 枚 鸡 胚，封 闭 进 针 孔，在 3 7 孵 化 箱 内 孵 育，每 隔 1 2 h 观 察 鸡 胚 死 亡 情 况。无 菌 收 集 2 4 h 9 6 h 死 亡 鸡 胚 及 9 6 h仍 存 活 鸡 胚 的 尿 囊 液，采 用 H I 试 验 测 定 尿 囊 液 有 无 H A 活 性。9.3 M D C K 细 胞 培 养具 体 操 作 步 骤 如 下：D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 15a)将 样 品 滤 过 液 接 种 于 长 成 致 密 单 层 的 M D C K 细 胞 瓶 内，置 于 3 5 3 7、含 5%C O 2 培 养箱 内 培 养，使 病 毒 吸 附 细 胞 2 h；b)弃 掉 样 品 液，用 D M E M 维 持 液（含 3%犊 牛 血 清）洗 一 遍，每 瓶 加 入 5 m L D M E M 维 持 液，置 于 3 5 3 7、5%C O 2 培 养 箱 内 培 养。维 持 液 成 份：D M E M 培 养 基，青 霉 素、链 霉 素、H E P E S、胰 酶 终 浓 度 分 别 为 1 0 0 I U/m L、1 0 0 g/m L、2 5 m m o l/L 和 2 g/m L，用 N a H C O 3 将p H 值 调 整 为 7.2，过 滤 除 菌，无 菌 检 验 合 格；c)逐 日 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 病 变，分 别 取 阴 性 对 照、未 出 现 病 变 的 和 出 现 病 变 的 细 胞 培 养 物上 清 液，用 H A 试 验 测 定 病 毒 的 血 凝 滴 度（效 价）；d)当 7 5%1 0 0%细 胞 出 现 病 变 时 收 获 病 毒，将 细 胞 瓶 放 于 7 0 冰 箱，冻 融 1 2 次 以 使 细 胞 破裂 及 释 放 病 毒。9.4 病 毒 血 凝（H A）试 验 和 血 凝 抑 制（H I）试 验9.4.1 病 毒 血 凝（H A）试 验病 毒 血 凝（H A）试 验 方 法：a)在 9 6 孔 V 型 微 量 反 应 板，每 孔 预 先 加 2 5 L P B S；b)向 第 1 孔 加 入 2 5 L 病 毒 溶 液（尿 囊 液 或 细 胞 培 养 物 上 清），反 复 吹 吸 3 次 5 次 混 匀；c)从 第 1 孔 吸 取 2 5 L 病 毒 溶 液 加 入 第 2 孔，混 匀 后 吸 取 2 5 L 加 入 第 3 孔，如 此 进 行 2 倍 连 续稀 释 至 第 1 1 孔，从 第 1 1 孔 吸 取 2 5 L 溶 液 弃 去，但 第 1 2 孔 加 入 2 5 L P B S 或 正 常 尿 囊 液 作为 阴 性 对 照 孔；d)每 孔 加 入 2 5 L P B S；e)每 孔 加 入 2 5 L 1%鸡 红 细 胞 悬 液；f)轻 轻 振 荡 血 凝 反 应 板 以 混 匀 反 应 体 系，室 温（2 0 2 5）静 置 4 0 m i n，或 4 静 置 6 0 m i n，当 阴 性 对 照 孔 的 红 细 胞 在 孔 底 汇 集 成 原 点 时 判 定 结 果。9.4.2 病 毒 血 凝 抑 制（H I）试 验病 毒 血 凝 抑 制（H I）试 验 方 法：a)在 9 6 孔 血 凝 反 应 板，每 孔 预 先 加 入 2 5 L P B S；b)向 第 一 孔 加 入 2 5 L 血 清 样 品，混 匀；c)在 血 凝 反 应 板 上 将 血 清 作 横 向 的 2 倍 连 续 稀 释，但 第 1 2 孔、第 1 3 孔、第 1 4 孔 和 第 1 5 孔 分 别设 置 为 加 2 5 L P B S 的 红 细 胞 对 照 孔、加 未 做 任 何 免 疫 禽 血 清 的 阴 性 对 照 孔、加 新 城 疫 病 毒 抗体 的 对 照 孔 和 加 禽 腺 病 毒 抗 体 的 对 照 孔（对 已 确 定 禽 流 感 病 毒 血 清 亚 型 的 分 离 毒 株，还 可 设 置阳 性 对 照 孔）；d)每 孔 加 入 2 5 L 4 H A U 的 病 毒 抗 原，室 温（2 0 2 5）静 置 不 少 于 3 0 m i n，或 4 静 置 不少 于 6 0 m i n；e)每 孔 加 入 2 5 L 1%R B C s，轻 轻 振 荡 混 匀，室 温（2 0 2 5）静 置 约 4 0 m i n，或 4 放 置约 6 0 m i n，当 红 细 胞 对 照 孔 呈 显 著 钮 扣 状 时 判 定 结 果。9.5 逆 转 录-聚 合 酶 链 式 反 应（R T-P C R）扩 增 检 测9.5.1 病 毒 R N A 的 提 取可 用 商 品 化 R N A 提 取 试 剂 盒 提 取 待 检 样 品（棉 拭 子、组 织 或 鸡 胚 尿 囊 液）、阳 性 对 照 样 品 及 阴 性对 照 样 品 的 病 毒 R N A。也 可 用 R N A 提 取 试 剂（如 T r i z o l）提 取，方 法 如 下：a)将 经 预 处 理 的 2 5 0 L 待 检 样 品 加 入 7 5 0 L R N A 提 取 试 剂 中，振 荡 2 m i n，室 温 放 置 5 m i n；D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 16b)加 入 2 5 0 L 氯 仿，在 微 型 振 荡 器 上 振 荡 1 m i n，室 温 放 置 5 m i n，4、1 2 0 0 0 r/m i n（约 1 4 0 0 0 g）离 心 1 5 m i n；c)转 移 上 层 水 相 至 新 离 心 管 中，加 入 等 量 的 异 丙 醇，充 分 混 匀，室 温 放 置 1 5 m i n，4 条 件 下1 2 0 0 0 r/m i n（约 1 4 0 0 0 g）离 心 1 5 m i n；d)小 心 吸 弃 上 清，加 入 预 先 经 D E P C 处 理 的 7 5%乙 醇 7 5 0 L，4、1 2 0 0 0 r/m i n（约 1 4 0 0 0 g）离 心 5 m i n；e)小 心 吸 弃 上 清，将 沉 淀 自 然 风 干 或 于 5 0 烘 干，加 适 量 的 经 D E P C 处 理 的 超 纯 水 溶 解；f)取 5 L 提 取 物 与 1 L 6 核 酸 上 样 缓 冲 液 混 匀，做 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 R N A 提 取 效 果，对 组 织 样 品 观 测 到 2 8 S、1 8 S 及 5.8 S r R N A 三 个 条 带 或 至 少 前 两 个 条 带，提 示 R N A 提 取 合 格；g)提 取 的 R N A 应 在 2 h 内 进 行 R T 或 R T-P C R 扩 增，若 需 长 期 保 存 R N A，应 置 于 8 0 冰 箱 或液 氮 内。9.5.2 R T-P C R 扩 增（一 步 法）取 提 取 的 R N A 3 L 和 每 对 引 物（见 表 1）各 1 L，配 制 R T-P C R 扩 增 体 系（见 表 2），盖 紧 P C R反 应 管 盖 子，置 于 P C R 仪 器 反 应 孔 内。扩 增 参 数：4 5 逆 转 录 4 5 m i n；9 4 预 变 性 2 m i n，9 4 变性 3 0 s、5 2 退 火 4 5 s、6 8 延 伸 4 5 s，3 5 个 循 环，最 后 6 8 延 伸 8 m i n。对 扩 增 任 何 亚 型 的 H 基 因（H x）中 包 含 F u r i n 酶 切 位 点 的 片 段，按 模 板 R N A 5 L，上、下 游 引 物组 合（见 表 1）各 1 L 配 制 R T-P C R 反 应 体 系。扩 增 参 数 除 退 火 温 度 设 置 为 5 0，其 余 参 数 不 变。表 1 禽 流 感 病 毒 P T-P C R 引 物目的基因 引物名称 引物序列 5 3 扩增产物长度（b p）MM-2 2 9 U T T C T A A C C G A G G T C G A A A C2 2 9M-2 2 9 L A A G C G T C T A C G C T G C A G T C CH 5H 5-3 7 2 U G G A A T A T G G T A A C T G C A A C A C C A3 6 9H 5-3 7 2 L A A C T G A G T G T T C A T T T T G T C A A T GH 7H 7-5 0 1 F A A T G C A C A R G G A G A G G G A A C T5 0 1H 7-5 0 1 R T G A Y G C C C C G A A G C T A A A C C AH 9H 9-2 7 3 F T G T G T C T T A C A G T G G G A C A A G C A2 7 3H 9-2 7 3 R T T G A C A A G A G G C C T T G G T C C T A TH xH A-1 0 5 7.1-FH A-1 0 5 7.2-FH A-1 0 5 7.3-FG G R G A A T G C C C C A A A T A Y G TG G R A R A T G C C C C A G R T A T G TG G R G A A T G C C C C A A R T A Y A T1 6 4 1 7 6 H A-1 2 3 2.1(5 5 5)-RH A-1 2 3 2.2(5 5 5)-RC T G A G T C C G A A C A T T G A G T T G C T A T G VT G R T A W C C A T A C C AC T G A G T C C G A A C A T T G A G T T Y T G A T G YC T G A A D C C R T A C C A注：R=(A/G)，Y=(C/T)，W=(A/T)；斜体字母表示非病毒序列D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 17表 2 R T-P C R 扩 增 体 系组分 体积（L）无 R N A 酶灭菌超净水 1 4.61 0 扩增反应缓冲液 2.5d N T P s（2.5 m m o l/L e a c h）2.0R N a s e 抑制剂（4 0 U/L）0.5A M V 反转录酶（5 U/L）0.7T a q D N A 聚合酶(5 U/L)0.7上游引物 P 1（2 0 m o l/L)0.5下游引物 P 2(2 0 m o l/L)0.5模板 R N A 3.0总计 2 5.09.5.3 电 泳取 P C R 产 物 按 常 规 方 法 用 1%琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 检 查（电 压 8 V 1 0 V/c m 凝 胶 长 度，3 0 m i n 4 0 m i n）。9.5.4 照 胶用 凝 胶 成 像 系 统 在 紫 外 光 下 进 行 拍 照 凝 胶，记 录 P C R 扩 增 结 果。9.6 H 蛋 白 序 列 分 析取 H A 滴 度 阳 性，新 城 疫 病 毒 抗 体 和 禽 腺 病 毒 抗 体 H I 滴 度 阴 性 的 鸡 胚 尿 囊 液 或 M D C K 细 胞 培 养 物 上清，按 9.5 提 取 总 R N A 做 H 基 因 的 R T-P C R 扩 增。出 现 对 应 表 1 所 示 扩 增 产 物 大 小 的 H 5 亚 型 3 6 9 b p 条 带 或H x 亚 型 1 6 4 b p 1 7 6 b p 条 带，参 照 胶 回 收 试 剂 盒 方 法 回 收 条 带 内 的 扩 增 产 物，做 双 向 核 酸 测 序；根 据 基因 序 列 推 导 氨 基 酸 序 列，对 禽 流 感 病 毒 H 蛋 白 的 F u r i n 酶 切 位 点 进 行 碱 性 氨 基 酸 数 量 和 位 置 的 分 析。1 0 试 验 数 据 处 理1 0.1 H A 试 验 结 果 判 定判 定 如 下：a)将 血 凝 反 应 板 倾 斜 6 0，观 察 红 细 胞 有 无 泪 珠 样 流 淌，完 全 无 泪 珠 样 流 淌（出 现 1 0 0%凝 集）的 病 毒 最 高 稀 释 倍 数 判 为 该 病 毒 的 血 凝 效 价，即 代 表 1 个 H A U；b)血 凝 判 定 标 准：红 细 胞 均 匀 分 散 在 孔 内、倾 斜 血 凝 反 应 板 时 不 流 淌 判 为 完 全 凝 集，记 作+；7 5%凝 集 记 作+；5 0%凝 集 记 作+；2 5%凝 集 记 作+；红 细 胞 汇 集 于 孔 底 中 央 呈 圆 点、倾 斜 血凝 反 应 板 时 与 对 照 孔（仅 含 2 5 L R B C s 和 5 0 L P B S）R B C s 流 淌 相 同 的 孔 判 定 为 不 凝 集，记作。1 0.2 H I 试 验 结 果 判 定判 定 如 下：D B 5 3/T 1 0 6 4.2 2 0 2 18a)红 细 胞 均 匀 分 散 在 孔 底 周 围、倾 斜 血 凝 反 应 板 时 不 流 淌 判 为 完 全 凝 集，记 作+，7 5%凝 集记 作+，5 0%凝 集 记 作+，2 5%凝 集 记 作+，红 细 胞 集 中 在 孔 底 中 央 呈 圆 点、倾 斜 血 凝 反 应 板时 与 对 照 孔（仅 含 2 5 L R B C s 和 5 0 L P B S）R B C s 流 淌 相 同 的 孔 判 定 为 不 凝 集 或 血 凝 被 抑制，记 作；b)完 全 抑 制 4 H A U 病 毒 抗 原 的 血 清 最 高 稀 释 倍 数 为 该 血 清 抗 体 的 H I 滴 度；c)检 查 各 种 对 照：阴 性 对 照 血 清 H I 滴 度 不 高 于 4(22或 2 l o g 2)，阳 性 对 照 血 清 H I 滴 度 与 已 知 滴度 误 差 不 超 过 1 个 滴 度，红 细 胞 对 照 无 自 凝 现 象，结 果 有 效，试 验 成 立；d)如 果 高 于 1:1 6（24或 4 l o g 2）稀 释 度 的 血 清 能 完 全 抑 制 4 H A U 的 病 毒 抗 原，判 定 该 H I 滴 度 为阳 性，表 明 未 经 免 疫 个 体 发 生 禽 流 感 病 毒 感 染；e)如 果 血 清 H I 滴 度 为 1 6，判 为 可 疑，需 重 复 H I 试 验，若 H I 滴 度 仍 为 1 6，可 判 定 血 清 抗 体 阳性，若 H I 滴 度 为 8 则 判 定 为 血 清 抗 体