绿孔雀检疫技术 第1部分：禽副黏病毒实验室检测技术规范DB53／T 1064.1-2021.pdf

I C S 1 1.2 2 0C C S B 4 1云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 1绿 孔 雀 检 疫 技 术绿 孔 雀 检 疫 技 术第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范Q u a r a n t i n e t e c h n i q u e f o r P a v o m u t i c u s P a r t 1:T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n s f o r l a b o r a t o r y e x a m i n a t i o n o fa v i a n p a r a m y x o v i r u s e s2 0 2 1-0 9-3 0 发 布 2 0 2 1-1 0-1 4 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局发 布53D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 1I目 次前 言.I I I引 言.I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 缩 略 语.25 总 则.26 仪 器 设 备 和 试 剂.26.1 实 验 室 设 备.26.2 试 剂.37 样 品.37.1 采 样 要 求 与 原 则.37.2 采 集 工 具.37.3 样 品 类 型 与 采 样 方 法.37.4 采 样 登 记 表 的 填 写.47.5 样 品 的 保 存 和 运 输.48 试 验 步 骤.48.1 鸡 胚 接 种（病 毒 分 离）.48.2 病 毒 血 凝（H A）试 验 和 血 凝 抑 制（H I）试 验.48.3 禽 副 黏 病 毒 L 和 M 基 因 的 R T-P C R 扩 增.58.4 新 城 疫 病 毒 F 基 因 的 R T-P C R 扩 增 及 测 序 分 析.69 试 验 数 据 处 理.79.1 H A 试 验 结 果 判 定.79.2 H I 试 验 结 果 判 定.79.3 L 和 M 基 因 扩 增 结 果 判 定.79.4 F 基 因 扩 增 结 果 及 毒 力 判 定.7附 录 A（规 范 性）试 剂 配 制.8附 录 B（规 范 性）采 样 记 录 表.1 0附 录 C（规 范 性）R T-P C R 引 物.1 1D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 1I I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。本 文 件 D B 5 3/T 1 0 6 4 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 1 部 分。D B 5 3/T 1 0 6 4 已 经 发 布 了 以 下 部 分：第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 3 部 分：羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局、云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 2）归 口。本 文 件 主 要 起 草 单 位：云 南 农 业 大 学、云 南 省 标 准 化 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：陈 培 富、黄 艳 梅、胡 世 享、杨 敏、卓 娜、李 宁、钱 丽 敏、邹 丰 才、何 依 蓉、杨建 发。D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 1引 言绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）在 我 国 仅 分 布 于 云 南，是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物，也 是 全 球 濒 危 物 种，并 已 列 入 濒 危 野 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约(C I T E S)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录。为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法，编 制 并 发 布 D B 5 3/T 1 0 6 4 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准，可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相 关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断，从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施，以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率，维 护 绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效。本 文 件 已 发 布 4 个 部 分：第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、仪器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范；第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、禽流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范；第 3 部 分：羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理、试 验 条 件、仪 器 设 备和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范；第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理、常 见 线 虫 形 态 特 征、试 验 条 件、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范。D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 11绿 孔 雀 检 疫 技 术第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示：本 检 测 技 术 规 范 中，氯 仿 有 中 等 毒 性，操 作 时 应 在 通 风 条 件 下 进 行 并 戴 手 套 和 口 罩，不小 心 接 触 皮 肤 应 立 即 冲 洗；凝 胶 电 泳 若 使 用 溴 化 乙 啶（E B）作 核 酸 染 色 剂，操 作 时 应 戴 手 套 和 口 罩，被E B 污 染 的 物 品 要 进 行 无 害 化 处 理；操 作 焦 碳 酸 二 乙 酯（D E P C）应 戴 手 套 和 口 罩 并 在 通 风 条 件 下，不 小 心接 触 皮 肤 应 立 即 冲 洗。由 于 新 城 疫 病 毒 可 引 起 人 一 过 性 结 膜 炎，采 样 及 检 测 人 员 应 佩 戴 口 罩 和 防 护 眼 镜，并 采 取 必 要 的 消 毒 措 施。本 文 件 中 凡 接 触 病 毒 样 品 的 检 验 器 材、废 弃 物 及 其 包 装 物 均 应 做 消 毒 或 灭 菌 无害 化 处 理，以 免 污 染 环 境 或 扩 散 病 毒。1 范 围本 文 件 规 定 了 绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）检 疫 技 术 中 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 涉 及 的 总 则、仪 器 设备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，标 注 日 期 的 引 用 文件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 标 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适用 于 本 文 件。N Y/T 5 4 1 兽 医 诊 断 样 品 采 集、保 存 与 运 输 技 术 规 范N Y/T 1 9 4 8 兽 医 实 验 室 生 物 安 全 要 求 通 则3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1禽 副 黏 病 毒 a v i a n p a r a m y x o v i r u s e s一 类 感 染 家 禽 和 野 禽 的 单 链 负 股 R N A 病 毒，属 于 副 黏 病 毒 科（P a r a m y x o v i r i d a e）、副 黏 病 毒 亚 科（P a r a m y x o v i r i n a e）、禽 腮 腺 炎 病 毒 属（A v u l a v i r u s），包 括 至 少 禽 副 黏 病 毒 1 9 血 清 型，其 中 禽 副 黏 病毒 1 型 又 称 作 新 城 疫 病 毒（N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s），其 致 病 性 最 受 关 注。3.2F 蛋 白 酶 切 位 点 c l e a v a g e s i t e o f F p r o t e i n新 城 疫 病 毒 融 合 蛋 白（F）的 F 2 亚 基（位 于 F 氨 基 端）与 F 1 亚 基（位 于 F 羧 基 端）之 间 被 宿 主 细 胞 蛋白 内 切 酶 识 别 的 一 个 短 肽，由 1 1 3 1 1 7 位 氨 基 酸 残 基 组 成，其 中 1 1 3 1 1 6 位 可 能 含 多 个 碱 性 氨 基 酸，如精 氨 酸（R）或 赖 氨 酸（K）。3.3病 毒 血 凝 试 验 v i r a l h e m a g g l u t i n a t i o n t e s tD B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 12利 用 有 血 凝 活 性 的 病 毒 与 特 定 动 物 的 红 细 胞 结 合 而 使 红 细 胞 凝 集（即 红 细 胞 不 再 自 然 下 沉 汇 集）的特 性，测 定 病 毒 效 价 即 滴 度 的 方 法。3.4病 毒 血 凝 抑 制 试 验 v i r a l h e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i o n t e s t使 用 抗 体 阻 断 或 抑 制 病 毒 的 血 凝 活 性，用 于 测 定 血 清 抗 体 效 价 或 病 毒 种 类 的 一 种 方 法。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。A M V：禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 A v i a n m y e l o b l a s t o s i s v i r u sc D N A：互 补 D N A c o m p l e m e n t a r y D N AD E P C：焦 碳 酸 二 乙 酯 D i e t h y p y r o c a r b o n a t ed N T P：脱 氧 核 苷 酸 D e o x y r i b o n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t eE B：溴 化 乙 啶 E t h i d i u m b r o m i d eF：融 合 蛋 白 F u s i o n p r o t e i nH A：血 凝 H e m a g g l u t i n a t i o nH A U：血 凝 单 位 H e m a g g l u t i n a t i o n u n i tH I：血 凝 抑 制 H e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i o nL：大 聚 合 酶 蛋 白 L a r g e p o l y m e r a s e p r o t e i nM：基 质 蛋 白 M a t r i x p r o t e i nN D V：新 城 疫 病 毒 N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u sP B S：磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 P h o s p h a t e-b u f f e r e d s a l i n eP C R：聚 合 酶 链 式 反 应 P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o nR B C s：红 细 胞 R e d b l o o d c e l l sR N A：核 糖 核 酸 R i b o n u c l e i c a c i dR T-P C R：反 转 录-聚 合 酶 链 式 反 应 R e v e r s e-t r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o nS P F：无 特 定 病 原 体 S p e c i f i c p a t h o g e n f r e e5 总 则5.1 采 用 鸡 胚 接 种 方 法 从 绿 孔 雀 检 测 样 品 分 离 禽 副 黏 病 毒。5.2 取 5.1 得 到 的 鸡 胚 尿 囊 液 做 病 毒 血 凝（H A）试 验 和 血 凝 抑 制（H I）试 验，确 定 分 离 毒 株 的 种 属 和血 清 型（亚 型）。5.3 用 R T-P C R 扩 增 分 离 毒 株 的 R N A 聚 合 酶（L）基 因 和 基 质 蛋 白（M）基 因，对 禽 副 黏 病 毒 及 其 第 1血 清 型（新 城 疫 病 毒）分 别 做 出 鉴 定。5.4 对 5.2 或 5.3 确 定 的 新 城 疫 病 毒 分 离 株，采 取 R T-P C R 扩 增 其 融 合 蛋 白（F）基 因，再 做 测 序 分 析，对 新 城 疫 病 毒 分 离 株 做 出 毒 力 判 定。6 仪 器 设 备 和 试 剂6.1 实 验 室 设 备6.1.1 P C R 仪：温 度 范 围 4.0 9 9.9，样 品 基 座 配 置 至 少 包 括 单 个 0.2 m L 孔。D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 136.1.2 凝 胶 成 像 系 统：对 E B 染 色 的 D N A 检 测 灵 敏 度 低 至 0.1 n g；有 效 像 数 1 3 6 0 1 0 2 4、1 0 b i t，数据 线 接 口 U S B 2.0。6.1.3 冷 冻 高 速 离 心 机：最 高 离 心 力 2 0 0 0 0 g；容 量 1.5 m L 1 2。6.1.4 电 泳 仪：电 压 5 0 V 1 2 0 V，电 流 1 0 m A 8 0 0 m A，定 时 0 m i n 9 9 9 m i n。6.1.5 电 泳 槽：耐 高 温、耐 腐 蚀、不 漏 液；缓 冲 液 新 鲜 且 容 量 充 足。6.1.6 冰 箱：具 有 冷 藏 和 冷 冻 功 能 分 区（2 0 4）。6.1.7 微 量 移 液 器：单 道 可 调，量 程 0.5 L 1 0 L、2 L 2 0 L、1 0 L 1 0 0 L 和 1 0 0 L 1 0 0 0 L。6.1.8 水 浴 锅：温 度 范 围 2 0 1 0 0。6.1.9 过 滤 器：一 次 性 无 菌 用 品，内 含 孔 径 0.4 5 m 的 滤 膜。6.1.1 0 V 形 孔 血 凝 反 应 板：一 次 性 或 可 重 复 使 用 的 血 凝 反 应 板。6.2 试 剂6.2.1 阿 氏 液（A l s e v e r s S o l u t i o n），p H 7.2、0.0 1 m o l/L 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液（P B S）、1%健 康 未 免 疫 鸡红 细 胞 悬 液、标 准 新 城 疫 病 毒 抗 原、阳 性 对 照 血 清 和 阴 性 对 照 血 清。6.2.2 R N A 提 取 试 剂 盒、氯 仿、异 丙 醇、7 5%乙 醇、1.0%琼 脂 糖 凝 胶、5 0 T A E 缓 冲 液、1 0 g/L 溴化 乙 啶（E B）或 其 他 可 替 代 的 核 酸 染 料、D N A 分 子 量 标 准、2 T a q M a s t e r M i x、无 R N A 酶 灭 菌 超 纯 水（D E P C 处 理 水）、1 0 扩 增 反 应 缓 冲 液、d N T P s、R N a s e 抑 制 剂（4 0 U/L)、A M V 反 转 录 酶（5 U/L）、胶 回 收 试 剂 盒。6.2.3 试 剂 配 制 见 附 录 A。7 样 品7.1 采 样 要 求 与 原 则7.1.1 采 样 应 符 合 N Y/T 5 4 1 的 要 求。7.1.2 采 集 的 样 品 具 有 代 表 性，应 从 濒 死、死 禽 和 处 于 急 性 发 病 期 的 绿 孔 雀 采 集 样 品，对 暴 发 疫 病 的群 体 宜 采 集 多 只 发 病 或 死 亡 个 体 的 样 品，采 样 过 程 应 无 菌 操 作，容 器 应 密 封，注 意 避 免 被 污 染。7.2 采 集 工 具棉 拭 子、剪 刀、镊 子、1.5 m L 离 心 管、研 钵 等 采 样 工 具 经 1 2 1、2 0 m i n 高 压 灭 菌 并 烘 干。7.3 样 品 类 型 与 采 样 方 法7.3.1 组 织 样 品取 病 死 孔 雀 待 检 样 品，采 集 肺 脏（或 气 管）、脑、心、肝、脾、胃、肾 等 组 织 各 1 份，每 份 不 少 于3 g，置 于 洁 净 样 品 袋 或 平 皿 内。将 样 品 封 口 贴 上 标 签，做 好 标 记。7.3.2 拭 子 样 品7.3.2.1 取 待 检 样 品，采 集 喉 气 管 拭 子 和 泄 殖 腔 拭 子（或 新 鲜 粪 样）各 1 份，将 拭 子 样 品 端 剪 下 或 折断，分 别 置 于 无 菌 试 管 或 器 皿 中，加 1.0 m L 1.5 m L 含 抗 生 素 的 P B S。将 样 品 封 口，贴 上 标 签，做 好标 记。7.3.2.2 抗 生 素 含 量 视 具 体 情 况 而 定：a)对 气 管 拭 子，P B S 应 含 青 霉 素（1 0 0 0 U/m L）、链 霉 素（1 m g/m L）或 卡 那 霉 素（5 0 g/m L）和 制 菌 霉 素（1 0 0 0 U/m L）；D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 14b)对 泄 殖 腔 拭 子 和 粪 便 P B S，上 述 抗 生 素 浓 度 应 提 高 至 5 倍。7.3.3 血 清 样 品采 集 静 脉 血 液 2 m L 3 m L 于 无 菌 离 心 管 中，自 然 放 置 析 出 血 清，3 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，将 血 清 转移、分 装 于 新 的 无 菌 试 管 中，盖 紧 盖 子，封 好 口，贴 上 标 签。不 同 个 体 的 血 清 样 品 不 能 混 合。7.3.4 整 只 采 样将 病 死 孔 雀 装 入 封 闭 的 无 毒 塑 料 袋 内，至 少 用 两 层 塑 料 袋 包 装，封 口 并 贴 上 标 签，作 好 标 记。7.4 采 样 登 记 表 的 填 写填 写 采 样 记 录 表（见 附 录 B），样 品 编 号 应 与 标 签 一 致，随 样 品 送 至 符 合 N Y/T 1 9 4 8 要 求 的 实 验 室。7.5 样 品 的 保 存 和 运 输7.5.1 样 品 应 置 于 加 干 冰 或 冰 袋 的 保 温 瓶 或 隔 热 泡 沫 盒 中 运 输，也 可 用 液 氮 罐 运 输，保 温 容 器 应 密 封，防 止 渗 漏。保 温 容 器 外 贴 封 条，封 条 有 贴 封 人（单 位）签 字 或 盖 章，并 注 明 贴 封 日 期。7.5.2 所 有 样 品 在 4 以 下 运 输，拭 子 样 品 和 组 织 样 品 应 作 暂 时 的 冷 藏（4）或 冷 冻（2 0）处理，随 即 送 至 实 验 室。7.5.3 血 清 样 品 宜 单 独 存 放。若 2 4 h 内 可 运 达 实 验 室，在 保 温 箱 内 加 冰 袋 冷 藏 运 输；若 超 过 2 4 h，应先 冷 冻，其 后 在 保 温 箱 内 加 大 量 冰 袋 运 输，途 中 不 能 超 过 4 8 h。7.5.4 各 种 样 品 到 达 实 验 室 后，若 暂 时 不 进 行 处 理，则 应 冷 冻（2 0 以 下）保 存，不 应 反 复 冻 融。8 试 验 步 骤8.1 鸡 胚 接 种（病 毒 分 离）8.1.1 样 品 处 理将 棉 拭 子 在 P B S 中 充 分 混 匀 至 拭 子 上 没 有 肉 眼 可 见 的 样 品；粪 便、研 碎 的 组 织 加 样 品 稀 释 液 充 分 研磨，按 照 1 g 组 织 加 1 0 m L P B S 的 比 例 混 成 悬 液。样 品 液 经 3 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，取 上 清 液 用 滤 器 过 滤，再 取 滤 过 液 作 为 接 种 材 料。8.1.2 样 品 接 种取 按 8.1.1 处 理 完 毕 的 样 品，以 0.2 m L/胚 的 量 经 尿 囊 腔 途 径 接 种 孵 化 9 d 1 1 d 的 S P F 鸡 胚，每 个 样 品接 种 3 5 枚 鸡 胚，在 3 7 孵 化 箱 内 孵 育，每 天 上 午 和 下 午 定 点 观 察 鸡 胚 死 亡 情 况。无 菌 收 集 2 4 h 9 6 h死 亡 鸡 胚 及 9 6 h 仍 存 活 鸡 胚 的 尿 囊 液，用 于 病 毒 血 凝 试 验 以 测 定 有 无 H A 活 性。8.2 病 毒 血 凝（H A）试 验 和 血 凝 抑 制（H I）试 验8.2.1 病 毒 血 凝（H A）试 验8.2.1.1 在 9 6 孔 V 型 微 量 反 应 板，每 孔 预 先 加 2 5 L P B S。8.2.1.2 向 第 1 孔 加 入 2 5 L 尿 囊 液，反 复 吹 吸 3 次 5 次 混 匀。8.2.1.3 从 第 1 孔 吸 取 2 5 L 溶 液 加 入 第 2 孔，混 匀 后 吸 取 2 5 L 加 入 第 3 孔，如 此 进 行 2 倍 连 续 稀释 至 第 1 1 孔，从 第 1 1 孔 吸 取 2 5 L 溶 液 弃 去，但 第 1 2 孔 加 入 2 5 L P B S 或 正 常 尿 囊 液 作 为 阴 性 对 照孔。D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 158.2.1.4 每 孔 加 入 2 5 L P B S。8.2.1.5 每 孔 加 入 2 5 L 1%鸡 红 细 胞 悬 液。8.2.1.6 轻 轻 振 荡 血 凝 反 应 板 以 混 匀 反 应 体 系，室 温（2 0 2 5）静 置 4 0 m i n，或 4 静 置 6 0 m i n，当 阴 性 对 照 孔 的 红 细 胞 在 孔 底 汇 集 成 原 点 时 判 定 结 果。8.2.2 病 毒 血 凝 抑 制（H I）试 验8.2.2.1 在 9 6 孔 血 凝 反 应 板，每 孔 预 先 加 入 2 5 L P B S。8.2.2.2 向 第 一 孔 加 入 2 5 L 血 清 样 品，混 匀。8.2.2.3 在 血 凝 反 应 板 上 将 血 清 作 横 向 的 2 倍 连 续 稀 释，但 第 1 2 孔、第 1 3 孔、第 1 4 孔 和 第 1 5 孔 分别 设 置 为 加 2 5 L P B S 的 红 细 胞 对 照 孔、加 未 做 任 何 免 疫 禽 血 清 的 阴 性 对 照 孔、加 禽 流 感 病 毒 抗 体 的 对照 孔 和 加 禽 腺 病 毒 抗 体 的 对 照 孔（对 已 确 定 禽 副 黏 病 毒 血 清 型 的 分 离 毒 株，还 可 设 置 阳 性 对 照 孔）。8.2.2.4 每 孔 加 入 2 5 L 4 H A U 的 病 毒 抗 原，室 温（2 0 2 5）静 置 不 少 于 3 0 m i n，或 4 静 置 不少 于 6 0 m i n。8.2.2.5 每 孔 加 入 2 5 L 1%R B C s，轻 轻 振 荡 混 匀，室 温（2 0 2 5）静 置 约 4 0 m i n，或 4 放 置约 6 0 m i n，当 红 细 胞 对 照 孔 呈 显 著 钮 扣 状 时 判 定 结 果。8.3 禽 副 黏 病 毒 L 和 M 基 因 的 R T-P C R 扩 增8.3.1 病 毒 R N A 的 提 取可 用 商 品 化 R N A 提 取 试 剂 盒 提 取 待 检 样 品（棉 拭 子、组 织 或 鸡 胚 尿 囊 液）、阳 性 对 照 样 品 及 阴 性对 照 样 品 的 病 毒 R N A。也 可 用 R N A 提 取 试 剂（如 T r i z o l）提 取，方 法 如 下：a)将 经 过 预 处 理 的 2 5 0 L 待 检 样 品 加 入 7 5 0 L R N A 提 取 试 剂（如 T r i z o l）中，振 荡 2 m i n，室温 放 置 5 m i n；b)加 入 2 5 0 L 氯 仿，在 微 量 振 荡 器 上 振 荡 1 m i n，室 温 放 置 5 m i n 后，4、1 2 0 0 0 r/m i n（约 1 4 0 0 0 g）离 心 1 5 m i n；c)吸 取 上 层 水 相 转 入 一 新 的 离 心 管 中，加 入 等 量 的 异 丙 醇，混 匀，室 温 放 置 1 5 m i n，4、1 2 0 0 0r/m i n（约 1 4 0 0 0 g）离 心 1 5 m i n；d)小 心 吸 弃 上 清，加 入 D E P C 处 理 的 7 5%乙 醇 7 5 0 L，4、1 2 0 0 0 r/m i n（约 1 4 0 0 0 g）离 心5 m i n；e)小 心 吸 弃 上 清，将 沉 淀 自 然 风 干 或 于 5 0 干 燥 箱 中 晾 干，加 适 量 的 D E P C 处 理 水 溶 解；f)取 5 L 提 取 物 与 1 L 6 核 酸 上 样 缓 冲 液 混 匀，做 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 R N A 提 取 效 果，对 组 织 样 品 观 测 到 2 8 S、1 8 S 及 5.8 S r R N A 三 个 条 带 或 至 少 前 两 个 条 带，提 示 R N A 提 取 合 格；g)提 取 的 R N A 应 在 2 h 内 进 行 R T 或 R T-P C R 扩 增，若 需 长 期 保 存 R N A，应 置 于 8 0 冰 箱 或液 氮 内。8.3.2 R T-P C R 扩 增（两 步 法）8.3.2.1 反 转 录 反 应（c D N A 的 合 成）：取 提 取 的 R N A 1 1 L，加 入 2 L、1 0 m o 1/L 的 反 转 录 引 物（见 附 录 C），4 L 5 反 转 录 缓 冲 液、0.5 L 反 转 录 酶、0.5 L R N A 酶 抑 制 剂、2 L d N T P M i x t u r e 至2 0 L，4 2 孵 育 1 h，即 得 到 c D N A 溶 液，直 接 用 于 P C R 扩 增 或 2 0 冻 存 备 用。8.3.2.2 P C R 扩 增 体 系：在 反 应 管 中 依 次 加 入 8 L 无 核 酸 酶 水、1 0 L 2 T a q M a s t e r M i x、1 L 上 述c D N A 溶 液、0.5 L 上 游 引 物 和 0.5 L 下 游 引 物（见 附 录 C，引 物 浓 度 均 为 1 0 m o l/L），混 匀，瞬 时离 心，使 液 体 全 部 集 中 于 管 底。D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 168.3.2.3 P C R 扩 增 条 件：9 4 预 变 性 3 m i n，9 4 变 性 1 0 s，5 6 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 2 5 s，循 环 3 0次，7 2 延 伸 5 m i n。扩 增 反 应 结 束 后 立 即 取 扩 增 产 物 进 行 电 泳 检 查 或 置 于 4 冰 箱 备 用。8.3.3 扩 增 产 物 的 电 泳 检 测制 备 1.5%琼 脂 糖 凝 胶 板。在 电 泳 槽 内 加 入 1 T A E 电 泳 缓 冲 液，使 液 面 刚 刚 没 过 凝 胶。取 3 L 5 L扩 增 产 物 加 到 凝 胶 孔，加 入 5 L D N A 分 子 量 标 准。恒 压（8 V 1 0 V/c m 凝 胶 长 度）电 泳 3 0 m i n 4 0 m i n，随 后 取 出 凝 胶，置 于 凝 胶 成 像 系 统 下 观 察 扩 增 结 果。8.4 新 城 疫 病 毒 F 基 因 的 R T-P C R 扩 增 及 测 序 分 析8.4.1 病 毒 R N A 的 提 取按 照 8.3.1 步 骤 进 行。8.4.2 引 物针 对 新 城 疫 病 毒 F 基 因 设 计 的 引 物 见 附 录 C。8.4.3 R T-P C R 扩 增（一 步 法）8.4.3.1 R T-P C R 扩 增 体 系 配 制 见 表 1。体 系 配 好 后，盖 紧 P C R 反 应 管 盖，并 做 好 标 记。8.4.3.2 使 用 瞬 时 离 心 使 液 体 都 沉 降 到 P C R 管 底。同 时 设 立 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照。P C R 扩 增 程 序：4 2 反 转 录 3 0 m i n；9 5 预 变 性 3 m i n；9 4 变 性 3 0 s，5 5 退 火 3 0 s；7 2 延 伸 4 5 s 共 进 行 3 5 次 循 环；7 2 再 延 伸 7 m i n。P C R 产 物 置 于 4 保 存 或 2 0 冻 存 备 检。表 1 R T-P C R 扩 增 体 系组分 体积（L）无 R N A 酶灭菌超净水 1 4.61 0 扩增反应缓冲液 2.5d N T P s（2.5 m m o l/L e a c h）2.0R N a s e 抑制剂（4 0 U/L）0.5A M V 反转录酶（5 U/L）0.7T a q 酶（5 U/L）0.7F 基 因上游引物（1 0 m o l/L）0.5F 基 因下游引物（1 0 m o l/L）0.5模板 R N A 3.0总计 2 58.4.4 扩 增 产 物 电 泳 检 查参 照 8.3.3 操 作。8.4.5 测 序 分 析将 P C R 产 物 用 胶 回 收 试 剂 盒 回 收、纯 化，做 核 酸 测 序，所 获 序 列 用 D N A s t a r（5.0）分 析 并 在 N C B I网 站 上 做 B L A S T 在 线 比 对。根 据 核 苷 酸 序 列 推 导 分 离 毒 株 F 的 氨 基 酸 序 列，确 定 内 切 蛋 白 酶 识 别 位 点 的碱 性 氨 基 酸 数 量。D B 5 3/T 1 0 6 4.1 2 0 2 179 试 验 数 据 处 理9.1 H A 试 验 结 果 判 定9.1.1 将 血 凝 反 应 板 倾 斜 呈 约 6 0，观 察 R B C s 有 无 呈 泪 珠 样 流 淌，出 现 泪 珠 样 流 淌 的 反 应 孔 判 定 为 病毒 血 凝 阴 性。9.1.2 完 全 凝 集（无 泪 珠 样 流 淌）的 病 毒 最 大 稀 释 倍 数 为 该 病 毒 样 品（尿 囊 液）的 血 凝 滴 度，其 相 应的 病 毒 含 量 表 示 为 1 个 血 凝 单 位（H A U)，再 根 据 开 始 的 稀 释 倍 数 精 确 计 算 血 凝 滴 度。9.1.3 血 凝 判 定 标 准：红 细 胞 均 匀 分 散 在 孔 内、倾 斜 血 凝 板 时 不 流 淌 判 为 完 全 凝 集，记 作+；7 5%凝 集 记 作+；5 0%凝 集 记 作+；2 5%凝 集 记 作+；红 细 胞 汇 集 于 孔 底 中 央 呈 圆 点、倾 斜 血 凝 板 时 与 对 照孔（仅 含 2 5 L R B C s 和 5 0 L P B S）R B C s 流 淌 相 同 的 孔 判 定 为 不 凝 集，记 作。9.2 H I 试 验 结 果 判 定9.2.1 红 细 胞 均 匀 分 散 在 孔 底 周 围、倾 斜 血 凝 板 时 不 流 淌 判 为 完 全 凝 集，记 作+；7 5%凝 集 记 作+；5 0%凝 集 记 作+；2 5%凝 集 记 作+；红 细 胞 集 中 在 孔 底 中 央 呈 圆 点、倾 斜 血 凝 板 时 与 对 照 孔（仅 含 2 5 LR B C s 和 5 0 L P B S）R B C s 流 淌 相 同 的 孔 判 定 为 不 凝 集 或 血 凝 被 抑 制，记 作。9.2.2 完 全 抑 制 4 H A U 病 毒 抗 原 的 最 高 血 清 稀 释 倍 数 为 该 血 清 的 H I 滴 度。9.2.3 检 查 各 种 对 照：阴 性 对 照 血 清 H I 滴 度 不 高 于 4（记 作 22或 2 l o g 2），阳 性 对 照 血 清 H I 滴 度 应在 已 知 滴 度 的 一 个 稀 释 度 以 内，红 细 胞 对 照 应 无 自 凝 现 象，结 果 有 效，试 验 成 立。9.2.4 如 果 高 于 1:1 6（24或 4 l o g 2）稀 释 度 的 血 清 能 抑 制 4 H A U 的 病 毒 抗 原，H I 滴 度 被 判 为 H I 抗 体阳 性，表 明 动 物 发 生 新 城 疫 病 毒 感 染 或 接 种 过 新 城 疫 疫 苗。9.2.5 如 果 血 清 H I 滴 度 为 1 6，判 为 可 疑，需 重 复 H I 试 验，若 H I 滴 度 仍 为 1 6，可 判 定 血 清 抗 体 阳 性，若 H I 滴 度 为 8 则 判 定 为 血 清 抗 体 阴 性。9.2.6 在 所 有 的 确 诊 试 验 中 针 对 试 验 采 用 的 H A U 应 设 病 毒 H A 滴 度 的 追 溯 性 测 定。9.2.7 当 血 凝 活 性 不 被 禽 流 感 病 毒 抗 体 和 禽 腺 病 毒 抗 体 阻 断，便 可 初 步 判 定 为 禽 副 黏 病 毒 阳 性。9.3 L 和 M 基 因 扩 增 结 果 判 定使 用 L 基 因 引 物 做 P C R 扩 增 呈 阳 性 结 果 时，禽 副 黏 病 毒 各 血 清 型 的 扩 增 产 物 均 约 1 2 1 b p。进 而 使 用M 基 因 引 物 扩 增 N D V 阳 性 对 照、阴 性 对 照 和 待 测 分 离 毒 株，其 扩 增 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测，阴、阳 性 对 照 同 时 成 立 表 明 试 验 有 效，否 则 试 验 无 效。在 阴、阳 性 对 照 结 果 成 立 的 前 提 下，如 果 待 检 样 品 的R T-P C R 产 物 凝 胶 电 泳 后 在 约 3 0 0 b p 位 置 出 现 特 异 性 的