绿孔雀检疫技术 第4部分：消化道线虫实验室检测技术规范DB53／T 1064.4-2021.pdf

I C S 1 1.2 2 0C C S B 4 1云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 1绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实验 室 检 测 技 术 规 范Q u a r a n t i n e t e c h n i q u e f o r P a v o m u t i c u s P a r t 4:T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n s f o r l a b o r a t o r y e x a m i n a t i o n o f n e m a t o d e s i nd i g e s t i v e t r a c t2 0 2 1-0 9-3 0 发 布 2 0 2 1-1 0-1 4 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局发 布53D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 1I目 次前 言.I I I引 言.1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 缩 略 语.15 试 验 原 理.16 常 见 线 虫 形 态 特 征.27 试 验 条 件.27.1 实 验 室 通 用 要 求.27.2 人 员 要 求.27.3 生 物 安 全 要 求.28 仪 器 设 备 和 试 剂.28.1 主 要 仪 器 设 备.28.2 主 要 试 剂.29 样 品.31 0 试 验 步 骤.31 0.1 形 态 学 检 测.31 0.2 P C R 检 测.31 1 试 验 数 据 处 理.31 1.1 虫 卵 检 测.41 1.2 虫 体 检 测.4附 录 A（资 料 性）消 化 道 线 虫 的 基 本 形 态 特 征.5附 录 B（规 范 性）粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法.6附 录 C（资 料 性）绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 虫 卵 虫 体 镜 检 照 片.7D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 1I I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。本 文 件 是 D B 5 3/T 1 0 6 4 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 4 部 分。D B 5 3/T 1 0 6 4 已 经 发 布 了 以 下 部 分：第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 3 部 分：羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范；第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局、云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 2）归 口。本 文 件 主 要 起 草 单 位：云 南 农 业 大 学、云 南 省 标 准 化 研 究 院、云 南 省 动 物 卫 生 监 督 所、昆 明 动 物 园。本 文 件 起 草 人：杨 建 发、黄 艳 梅、张 誉 方、吴 长 江、邹 丰 才、朱 勋 程、陈 培 富、宋 海 洋、衡 昭 君、蒙 英 雯、朱 尤 帅、李 云 乔。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 1引 言绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）在 我 国 仅 分 布 于 云 南，是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物，也 是 全 球 濒 危 物 种，并 已 列 入 濒 危 野 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约(C I T E S)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录。为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法，编 制 并 发 布 D B 5 3/T 1 0 6 4 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准，可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相 关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断，从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施，以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率，维 护 绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效。本 文 件 已 发 布 4 个 部 分：第 1 部 分：禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、仪器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范；第 2 部 分：禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则、禽流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范；第 3 部 分：羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理、试 验 条 件、仪 器 设 备和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范；第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范。本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理、常 见 线 虫 形 态 特 征、试 验 条 件、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 11绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 4 部 分：消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范1 范 围本 规 范 明 确 了 绿 孔 雀（P a v o m u t i c u s）检 疫 技 术 中 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理、常 见 线虫 形 态 特 征、试 验 条 件、仪 器 设 备 和 试 剂、样 品、试 验 步 骤、试 验 数 据 处 理。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求G B/T 2 7 4 0 1 实 验 室 质 量 控 制 规 范 动 物 检 疫3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1线 虫 n e m a t o d e s线 虫 动 物 门 为 假 体 腔 动 物，线 虫 属 通 常 呈 圆 柱 形，线 状 或 毛 发 状，某 些 种 类 呈 鞭 状 或 球 状。不 分 节，两 侧 对 称 并 具 有 三 胚 层 假 体 腔，一 般 为 雌 雄 异 体。虫 体 大 小 随 种 类 不 同 差 别 较 大，雄 虫 一 般 较 雌 虫 为 小。寄 生 性 线 虫 最 常 见 寄 生 于 消 化 道。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。B L A S T：基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 B a s i c L o c a l A l i g n m e n t S e a r c h T o o lD N A：脱 氧 核 糖 核 酸 D e o x y r i b o n u c l e i c A c i dN C B I：美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心 N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o nP C R：聚 合 酶 链 式 反 应 P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o nT A E：T r i s-乙 酸 电 泳 缓 冲 液 T r i s A c e t a t e-E D T A B u f f e r5 试 验 原 理绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 的 检 测 可 采 用 形 态 学 观 察 线 虫 虫 卵 或 虫 体 的 方 法，当 镜 检 发 现 形 态 特 征 明 确 的 线虫 虫 卵，如 毛 细 线 虫，可 直 接 作 出 判 定；对 于 无 法 利 用 形 态 学 鉴 定 的 虫 卵 或 虫 体，进 一 步 采 用 P C R 方 法进 行 虫 种 鉴 定。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 126 常 见 线 虫 形 态 特 征绿 孔 雀 常 见 的 线 虫 主 要 有 蛔 虫（A s c a r i d i a）、异 刺 线 虫（H e t e r a k i s）和 毛 细 线 虫（C a p i l l a r i a）。绿 孔 雀 线 虫 的 基 本 形 态 特 征 参 见 附 录 A。7 试 验 条 件7.1 实 验 室 通 用 要 求实 验 室 应 满 足 G B 1 9 4 8 9 中 的 要 求。7.2 人 员 要 求采 样 和 试 验 人 员 应 具 有 相 应 的 专 业 知 识。7.3 生 物 安 全 要 求采 样 及 试 验 过 程 中 做 好 自 身 防 护，试 验 结 束 后 的 检 验 器 具 要 进 行 消 毒 处 理，废 弃 样 品 要 及 时 进 行 无害 化 集 中 处 理。8 仪 器 设 备 和 试 剂8.1 主 要 仪 器 设 备8.1.1 正 置 光 学 显 微 镜、体 视 显 微 镜。8.1.2 载 玻 片 及 盖 玻 片 若 干，漏 斗、玻 璃 棒、烧 杯。8.1.3 金 属 筛：6 0 目。8.1.4 P C R 扩 增 仪。8.1.5 高 速 台 式 离 心 机。8.1.6 电 子 天 平：量 程 0.0 1 m g 1 0 0 0 0 m g。8.1.7 恒 温 水 浴 锅：3 6 1，6 5 1。8.1.8 超 纯 水 器，高 压 灭 菌 锅。8.1.9 单 道 移 液 器（量 程 0.5 L 1 0 L、2 L 2 0 L、1 0 L 1 0 0 L 和 1 0 0 L 1 0 0 0 L）。8.1.1 0 电 泳 槽、电 泳 仪、紫 外 凝 胶 成 像 仪、涡 旋 振 荡 器。8.2 主 要 试 剂8.2.1 饱 和 食 盐 水。8.2.2 2.5%重 铬 酸 钾 液，乳 酸 酚 透 明 液。8.2.3 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒。8.2.4 2 T a q P C R M a s t e r M i x。8.2.5 D L 2 0 0 0 D N A M a r k e r。8.2.6 无 菌 水。8.2.7 5 0 T A E 缓 冲 液：T r i s 碱 2 4 2 g 和 5 7.1 m L 冰 醋 酸，用 双 蒸 水 定 容 到 1 L。8.2.8 核 酸 染 料，用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带。8.2.9 1%琼 脂 糖 凝 胶：1 g 琼 脂 糖 与 1 0 0 m L 1 T A E 缓 冲 液，加 热 融 化 均 匀，加 入 1 0 L 核 酸 染 料，6 0 时，倒 入 胶 槽，插 上 样 品 梳。室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后，垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 139 样 品样 品 从 绿 孔 雀 粪 便 中 采 集，采 样 和 保 存 方 法 见 附 录 B。1 0 试 验 步 骤1 0.1 形 态 学 检 测1 0.1.1 虫 卵 检 测采 用 饱 和 食 盐 水 漂 浮 法，线 虫 卵 富 集 在 饱 和 液 表 面。取 粪 样 5 g，加 饱 和 食 盐 水 5 0 m L，用 玻 璃 棒 搅匀，通 过 6 0 目 金 属 筛 或 双 层 纱 布 过 滤 到 干 净 烧 杯 中，静 置 0.5 h；蘸 取 表 面 液 膜，点 样 于 载 玻 片 上，盖上 盖 玻 片，进 行 镜 检。1 0.1.2 虫 体 检 测从 粪 样 中 分 离 虫 体，用 生 理 盐 水 清 洗 干 净，放 于 载 玻 片，滴 加 乳 酸 酚 透 明 液 2 3 滴，盖 上 盖 玻 片，在 光 学 显 微 镜 下 观 察 透 明 虫 体 的 内 部 形 态 构 造。对 于 存 疑 虫 体，结 合 下 述 P C R 扩 增 方 法 对 其 进 行 虫 种 鉴定。1 0.2 P C R 检 测1 0.2.1 D N A 的 提 取 和 保 存取 粪 样，用 商 品 化 D N A 提 取 试 剂 盒 进 行 D N A 提 取，步 骤 按 照 D N A 提 取 试 剂 盒 说 明 书 进 行。1 周 内 使 用 到的 D N A，保 存 于 4 冰 箱 中；需 要 长 期 保 存 的 D N A，保 存 于-2 0 冰 箱 中。1 0.2.2 P C R 扩 增1 0.2.2.1 P C R 扩 增 引 物针 对 线 虫 I T S 基 因 的 部 分 片 段 设 计 引 物，此 引 物 灵 敏 度 和 特 异 性 较 高。上 下 游 引 物 序 列 如 下：B D 1：5-G T C G T A A C A A G G T T T C C G T A-3；B D 2：5 A T G C T T A A A T T C A G C G G G T-3。1 0.2.2.2 P C R 扩 增 体 系P C R 扩 增 体 系 为 5 0 L，包 括 2 T a q P C R M a s t e r M i x 2 5.0 L，无 菌 水 1 9.0 L，引 物 B D 1 和 B D 2 各2.0 L，D N A 模 板 2.0 L。1 0.2.2.3 P C R 扩 增 程 序用 P C R 扩 增 仪 设 置 反 应 程 序，9 4 预 变 性 5 m i n；9 4 变 性 3 0 s，5 0 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 3 0 s，设置 3 0 个 循 环 反 应，最 后 7 2 延 伸 5 m i n，1 6 结 束 反 应，同 时 设 阴 性 对 照 和 阳 性 对 照。1 0.2.2.4 P C R 产 物 检 测P C R 扩 增 完 成 后，取 P C R 产 物 5 L，加 入 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 孔 中，以 D L 2 0 0 0 D N A M a r k e r 作 为 参 照，1 1 0 V 电 压 电 泳 3 0 m i n。将 凝 胶 取 出 放 入 紫 外 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 并 拍 照。若 出 现 预 期 的 1 0 0 0 b p 左 右 的 条带，扩 增 条 带 进 行 测 序 后 验 证。1 1 试 验 数 据 处 理D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 141 1.1 虫 卵 检 测经 饱 和 食 盐 水 漂 浮 法 镜 检 发 现 如 附 录 C 中 图 C.1 或 图 C.2 所 示 的 虫 卵，直 接 判 定 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫感 染 阳 性。若 发 现 存 疑 虫 卵，对 其 进 行 P C R 检 测 后，将 P C R 产 物 测 序 结 果 与 N C B I G e n B a n k 中 的 序 列 进 行B L A S T 在 线 比 对，判 定 是 否 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 感 染 阳 性。1 1.2 虫 体 检 测对 虫 体 进 行 镜 检 观 察 到 如 附 录 C 中 图 C.3 或 图 C.4 所 示 的 虫 体，直 接 判 定 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 感 染 阳性。若 发 现 存 疑 虫 体，对 其 进 行 P C R 检 测 后，将 P C R 产 物 测 序 结 果 与 N C B I G e n B a n k 中 的 序 列 进 行 B L A S T 在线 比 对，判 定 是 否 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 感 染 阳 性。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 15附 录 A（资 料 性）消 化 道 线 虫 的 基 本 形 态 特 征寄 生 于 孔 雀 体 内 的 线 虫 主 要 为 蛔 虫（A s c a r i d i a）、异 刺 线 虫（H e t e r a k i s）和 毛 细 线 虫（C a p i l l a r i a）：蛔 虫（A s c a r i d i a）呈 黄 白 色，圆 柱 状，雄 虫 长 2.6 c m 7 c m；雌 虫 长 6.5 c m 1 1 c m。虫 卵 呈椭 圆 形，深 灰 色，卵 壳 光 滑，大 小 为（7 0 9 0）m（4 7 5 1）m；异 刺 线 虫（H e t e r a k i s）属 于 异 刺 科 异 刺 属 线 虫，寄 生 于 孔 雀 等 禽 类 的 盲 肠。虫 体 呈 细 线 状，淡黄 色。雄 虫 长 7 m m 1 3 m m；雌 虫 长 1 0 m m 1 5 m m。虫 卵 呈 椭 圆 形，浅 灰 色，大 小 为（6 5 8 0）m（3 5 4 6）m；毛 细 线 虫（C a p i l l a r i a）成 虫 呈 乳 白 色。前 端 细 长，毛 发 状，虫 体 后 端 由 细 变 粗，形 状 呈 鞭 子样。雄 虫 长 2 3.7 m m 5 4.4 m m，尾 部 卷 曲；雌 虫 长 3 9.4 m m 5 3.0 m m，尾 部 稍 有 弯 曲。虫 卵呈 腰 鼓 形，黄 褐 色，卵 壳 较 厚，两 端 有 卵 塞，大 小（6 5 8 0）m（3 5 4 6）m。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 16附 录 B（规 范 性）粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法B.1 采 样 工 具一 次 性 P E 手 套、自 封 袋、样 品 管、照 相 机 等。B.2 粪 样 的 选 取 原 则B.2.1 采 集 绿 孔 雀 新 鲜 粪 样，同 一 堆 粪 样 只 采 集 一 份 样 品。B.2.2 如 遇 到 绿 孔 雀 母 幼 粪 样，分 开 采 集；依 据 母 绿 孔 雀 和 幼 绿 孔 雀 的 粪 样 大 小 有 明 显 差 异 作 出 判 断，并 在 备 注 栏 记 录。B.3 样 品 采 集 方 法B.3.1 在 采 集 用 于 消 化 道 线 虫 研 究 的 粪 样 时，采 集 较 为 新 鲜、无 污 染 的 粪 便 样 品，并 佩 戴 一 次 性 P E 手套。每 次 采 样 时 应 更 换 新 的 P E 手 套，以 避 免 样 品 间 的 交 叉 污 染。B.3.2 采 集 时，直 接 剥 取 分 离 新 鲜 粪 样 的 表 层 部 分 和 内 部 部 分，分 别 放 入 样 品 管 中，贴 上 样 品 标 签 纸，写 上 样 品 编 号 和 采 集 地 经 纬 度、海 拔，将 样 品 管 放 入 自 封 袋，并 再 次 写 上 样 品 编 号。B.3.3 同 一 堆 粪 样 应 尽 量 多 取 样 品。B.4 样 品 记 录 与 编 号在 采 集 粪 样 时，应 填 写 绿 孔 雀 粪 样 采 集 记 录 表（见 表 B.1）。记 录 采 样 包 括 样 品 编 号，采 集 管数，采 集 地 名 称，采 集 地 经 纬 度、海 拔，采 集 日 期，采 集 人 等 信 息。表 B.1 绿 孔 雀 粪 样 采 集 记 录 表样品编号 采集管数 采集地名称 采集地经纬度、海拔 采集日期 采集人B.5 样 品 的 临 时 保 存野 外 样 品 采 回 后，仔 细 检 查 核 对 标 签 和 记 录。有 条 件 时 在 4 冷 藏 保 存，直 到 样 品 送 到 相 关 实 验 室。B.6 样 品 的 运 输 和 实 验 室 保 存野 外 样 品 采 集 完 成 后 应 于 4 8 h 内 送 到 相 关 分 子 生 物 学 实 验 室，并 尽 快 进 行 D N A 提 取 工 作。运 输 过 程中 应 注 意 保 持 低 温，可 将 粪 样 静 置 于 冰 袋 上，用 泡 沫 箱 进 行 保 温。B.7 样 品 的 采 集、运 输 和 处 理 过 程 中 的 生 物 安 全粪 样 的 采 集、运 输 和 处 理 过 程 中 的 生 物 安 全 要 求 应 符 合 G B/T 2 7 4 0 1 实 验 室 质 量 控 制 规 范 的 要 求。D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 17附 录 C（资 料 性）绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 虫 卵 虫 体 镜 检 照 片绿 孔 雀 消 化 道 毛 细 线 虫 虫 卵 镜 检 照 片 如 图 C.1 所 示，蛔 虫 虫 卵 镜 检 照 片 如 图 C.2 所 示，毛 细 线 虫 虫 体镜 检 照 片 如 图 C.3 所 示，异 刺 线 虫 虫 体 镜 检 照 片 如 图 C.4 所 示。图 C.1 毛 细 线 虫 虫 卵 光 学 显 微 镜 镜 检 照 片（1 0 0）图 C.2 蛔 虫 虫 卵 光 学 显 微 镜 镜 检 照 片（1 0 0）D B 5 3/T 1 0 6 4.4 2 0 2 18图 C.3 毛 细 线 虫 虫 体 体 视 显 微 镜 镜 检 照 片（2 0）图 C.4 异 刺 线 虫 虫 体 体 视 显 微 镜 镜 检 照 片（2 0）_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _DB53/T 1 0 6 4.4 2 0 2 1