谷物中10 种真菌毒素的测定 液相色谱串 联质谱法DB34／T 2776-2016.pdf

ICS 67.040 C 53 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 27762016 谷物中10 种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法 Determination of 10 mycotoxins in grain by liquid chromatography tandem mass spectrometry 文稿版次选择 2016-12-30 发布 2017-01-30 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 27762016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、农业部农产品质量安全风险评估实验室（合肥）、安徽省畜牧技术推广总站、池州市农产品质量安全监测中心、安徽科立特农药环境科技评价有限公司、繁昌县植保站。本标准起草人：段劲生、高同春、孙明娜、王梅、李瑞、董旭、肖青青、褚玥、许四五、吴爱美、彭卫兵、朱玉杰、杨通。DB34/T 27762016 1 谷物中10 种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法 1 范围 本标准规定了谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等 10 种真菌毒素（参见附录A和附录D）残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于小麦、大米和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素（DON、15A-DON、3A-DON），黄曲霉素(B1、B2、G1、G2)，伏马毒素(FB1、FB2)和玉米赤霉烯酮(ZEA)残留量的测定。方法的检出限为 0.00021.0 mg/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法 GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义 GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样用乙腈+醋酸水溶液提取，经分散吸附剂净化，液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）定性确证和定量检测，外标法定量。4 试剂与材料 4.1 水为GB/T 6682 规定的二级水。4.2 乙腈：色谱纯。4.3 乙酸（冰醋酸）：分析纯。4.4 氯化钠：分析纯。4.5 无水硫酸镁：分析纯。4.6 PSA：分析纯，粒径4060 m。4.7 氨水：色谱纯。4.8 乙酸铵：色谱纯。4.9 甲酸：色谱纯。4.10 0.22 m微孔过滤膜。4.11 真菌毒素标准品（纯度95）。4.12 标准储备溶液：DB34/T 27762016 2 分别称取 10 种真菌毒素标准品，用乙腈配制成 1000 mg/L 的上述 10 种真菌毒素的各自标准储备溶液，于04下避光保存，有效期 3 个月。4.13 基质混合标准工作溶液：将 10 种标准储备液用空白样品基质溶液配制成不同浓度的基质混合标准工作溶液，待用。基质标准工作液现配现用。4.14 0.01氨水溶液：移取0.1 mL氨水（4.6）于 1000 mL 水中，混匀。4.15 2 mmol/L乙酸铵+0.1甲酸溶液：称取0.1542 g 乙酸铵（4.7）加少量水溶解，再加入 1.0 mL甲酸（4.8），混匀，定容到1000 mL，配成含 0.1甲酸的 2 mmol/L 的乙酸铵溶液，过 0.22m 微孔滤膜。5 仪器和设备 5.1 液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.2 万分之一分析天平。5.3 匀浆仪。5.4 超声波清洗器。5.5 离心机，转速不低于 3000 r/min。5.6 旋转蒸发仪。5.7 氮吹仪。5.8 涡旋仪。5.9 移液器。6 分析步骤 6.1 试样的制备与贮藏 按照 GB 5491 的规定分别将不少于 1000 g 小麦、大米（已脱壳）、玉米籽粒混匀，四分法取样，放入食品加工机粉碎，过 20 目筛，制成试样，放入试样瓶中密封，做上标记，并置于-20条件下保存，待测。6.2 提取 称取样品 21.0 g（精确至 0.01 g），加入含 1乙酸(冰醋酸）的乙腈：水=84:16（V:V）混合溶剂 50 mL，振荡 30 min，超声提取 10 min，加入适量氯化钠，5000 r/min 离心 3 min，取上清夜 2 mL，待净化。6.3 净化 取 2 mL 上述乙腈提取液于 5 mL 玻璃试管中，加入 200 mg 无水硫酸镁吸附剂，涡动混合 1 min，静置，过 0.22 m 滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。6.4 测定条件 6.4.1 液相色谱条件 a)色谱柱：C18分析柱，150 mm L.2.0 mm,I.D.2.2 m；b)流动相：DB34/T 27762016 3 A：0.01氨水溶液；B：甲醇；C：含2 mmol/L的乙酸铵和0.1甲酸的水溶液；D：乙腈；液相色谱流动相梯度洗脱具体见表 1、表 2。c)流速：400 L/min；d)柱温：40；e)进样量：5 L。表1 液相流动相梯度洗脱程序（测DON、15A-DON、3A-DON）时间 min 流速 mL/min 流动相 A（0.01氨水溶液）流动相 B（甲醇）2.0 0.4 10 90 4.0 0.4 10 90 4.1 0.4 90 10 5.0 0.4 90 10 表2 液相流动相梯度洗脱程序（测黄曲霉素B1、B2、G1、G2、伏马毒素 FB1、FB1、ZEA）时间 min 流速 mL/min 流动相 C（含 2 mmol/L 的乙酸铵和 0.1甲酸的水）流动相 D（乙腈）0.5 0.4 70 30 3.5 0.4 10 90 5.0 0.4 10 90 5.1 0.4 70 30 6.0 0.4 70 30 6.4.2 质谱条件 a)离子源：电喷雾离子源（ESI），450；b)扫描方式：正负离子扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；d)干燥气温度：250；e)干燥气流速：20 L/min；f)雾化器流速：3.0 L/min；g)离子源接口电压：ESI+，+4.5 kV；ESI-，-3.5 kV h)10种真菌毒素监测离子对、保留时间、碰撞电压及碰撞能量参见附录 B。6.5 液相色谱-质谱/质谱测定 6.5.1 定性测定 在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度50，允许 20偏差；相对丰度2050，允许 25偏差；相对丰度1020，允许 30偏差；相对丰度10，允许 50偏差）。DB34/T 27762016 4 6.5.2 定量测定 本方法采用外标校准曲线法单离子定量测定。为了减少基质对定量测定的影响，需用空白样液来制备所使用的一系列基质标准工作溶液，用基质标准工作溶液按浓度由小到大的顺序，分别进样来绘制标准曲线。并且保证所测试样中真菌毒素的响应值均在仪器的线性范围内。混合基质标准溶液的液相色谱质谱/质谱多反应监测（MRM）色谱图参见附录 C。6.6 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行测定。6.7 空白实验 除不称取试样外，均按上述步骤测定。7 结果计算 7.1 标准曲线 使用基质标准工作溶液进样，绘制基质标准工作曲线。待测物残留的响应值应在检测方法的线性范围之内。7.2 结果计算和表述 试样中 10 种真菌毒素的残留量按公式（1）计算：mVc Xi i.(1)式中：X 试样中被测组分的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C 从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V 试样定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样溶液所代表试样的重量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值。8 方法准确度和精密度 8.1 准确度 本方法在 0.0002 mg/kg 1.0 mg/kg 间添加浓度的回收率在 72.5108.3之间。8.2 精密度 本标准精密度数据是按照 GB/T 6379.1 和 GB/T 6379.2 的规定确定的，获得重复性和再现性的值是以 95的可信度来计算，本标准方法的精密度数据参见附录D。DB34/T 27762016 5 A A 附 录 A（资料性附录）10种真菌毒素中英文名称、方法检出限 表A.1 10种真菌毒素中英文名称、方法检出限 序号 中文名称 英文名称 分子量 检出限（mg/kg）1 DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）Deoxynivalenol 296.32 0.001 2 15A-DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）15-Acetyl-deoxynivalenol 337.25 0.001 3 3A-DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）3-Acetyl-deoxynivalenol 337.25 0.001 4 黄曲霉素B1 Aflatoxin B1 312.27 0.0002 5 黄曲霉素B2 Aflatoxin B2 314.29 0.0002 6 黄曲霉素G1 Aflatoxin G1 328.27 0.0002 7 黄曲霉素G2 Aflatoxin G2 330.29 0.001 8 伏马毒素B1 Fumonsin B1 721.83 0.01 9 伏马毒素B2 Fumonsin B2 705.83 0.01 10 玉米赤霉烯酮 Zearalenone 318.36 0.005 DB34/T 27762016 6 B B 附 录 B（资料性附录）10种真菌毒素监测离子对、保留时间、碰撞电压及碰撞能量 表B.1 10种真菌毒素监测离子对、保留时间、碰撞电压及碰撞能量 序号 名称 保留时间 ESI 模式 定量离子 定性离子 碰撞 电压1(V)碰撞能量 碰撞电压2(V)1 DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）1.304-295.20/265.25 295.20/265.25;295.20/138.15 11;11 15;15 14;15 2 15A-DON 1.783-337.20/229.05 337.20/229.05;337.20/150.15 17;17 15;15 26;17 3 3A-DON 1.783-337.25/307.30 337.25/307.30;337.25/59.25 13;13 15;25 24;19 4 黄曲霉素B1 1.569+313.20/241.00 313.20/241.00;313.20/285.00-26;-26-40;-25-20;-25 5 黄曲霉素B2 1.367+315.20/259.05 315.20/259.05;315.20/287.05-19;-19-30;-25-22;-25 6 黄曲霉素G1 1.355+329.20/199.95 329.20/199.95;329.20/243.00-13;-13-45;-25-16;-21 7 黄曲霉素G2 1.136+331.25/313.30 331.25/313.30;331.25/245.00-13;-13-25;-35-15;-20 8 伏马毒素B1 0.957+722.50/334.50 722.50/334.50;722.50/352.15-24;-24-40;-35-10;-16 9 伏马毒素B2 1.686+706.50/336.05 706.50/336.05;706.50/354.25-22;-22-40;-35-20;-22 10 玉米赤霉烯酮 2.497-317.20/175.00 317.20/175.00;317.20/131.10 24;24 25;30 21;14 DB34/T 27762016 7 C C 附 录 C（资料性附录）空白基质10种真菌毒素标准试样多反应监测（MRM）色谱图（50 g/L）空白基质 10 种真菌毒素标准试样多反应监测（MRM）色谱图（50 g/L）0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.000500100015002000250030001:295.20265.25(-)1/DON/1.302 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.5005001000150020002500300035004000 2:337.20150.15(-)1/15A-DON/1.776 1.DON 2.15A-DON(Deoxynivalenol)(15-Acetyl-deoxynivalenol)1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.5002500500075001000012500150003:337.25307.30(-)1/3A-DON/1.779 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.2505000100001500020000250004:313.20241.00(+)1/黄曲B1/1.569 3.3A-DON 4.黄曲霉素B1(3-Acetyl-deoxynivalenol)(Aflatoxin B1)0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.000500010000150002000025000300003:315.20259.05(+)1/黄 曲B2/1.372 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.000250050007500100001250015000175002:329.20199.95(+)1/黄曲G1/1.368 5.黄曲霉素B2 6.黄曲霉素G1(Aflatoxin B2)(Aflatoxin G1)DB34/T 27762016 8 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75010002000300040005000600070001:331.25313.30(+)1/黄 曲G2/1.138 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.7501002003004005006005:722.40352.30(+)1/伏马B1/1.072 7.黄曲霉素G2 8.伏马毒素B1(Aflatoxin G2)(Fumonsin B1)1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.2502505007506:706.50336.10(+)1/伏马B2/1.689 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25010002000300040007:317.20175.00(-)1/ZEA/2.499 9.伏马毒素B2 10.玉米赤霉烯酮(Fumonsin B2)(Zearalenone)DB34/T 27762016 9 D D 附 录 D（资料性附录）10种真菌毒素精密度数据表 表D.1 10 种真菌毒素精密度数据表 序号 名称 含量（mg/kg）重复性限 r 再现性限 R 含量（mg/kg）重复性限 r 再现性限 R 1 DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）0.01 0.0008 0.0009 0.5 0.0324 0.0515 2 15A-DON 0.01 0.0008 0.0026 0.5 0.0253 0.0970 3 3A-DON 0.01 0.0008 0.0011 0.5 0.0254 0.5134 4 黄曲霉素B1 0.01 0.0009 0.0012 0.5 0.0287 0.1022 5 黄曲霉素B2 0.01 0.0008 0.0020 0.5 0.0296 0.0795 6 黄曲霉素G1 0.01 0.0006 0.0009 0.5 0.0354 0.0383 7 黄曲霉素G2 0.01 0.0006 0.0017 0.5 0.0359 0.1290 8 伏马毒素B1 0.01 0.0007 0.0017 0.5 0.0297 0.0951 9 伏马毒素B2 0.01 0.0007 0.0016 0.5 0.0241 0.0581 10 玉米赤霉烯酮 0.01 0.0007 0.0025 0.5 0.0303 0.0915 _