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ICS 67.040 B 30 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 13712020 马铃薯抗晚疫病鉴定技术规程 Code of practice for evaluation of potato resistance to late blight 2020-12-29发布 2021-07-01实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 13712020 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 仪器与试剂耗材.2 5 抗性鉴定.2 6 病情调查.3 7 抗性评价.4 8 接种后材料的处理.5 附录 A（资料性）马铃薯晚疫病植株症状和病原菌生物学特性.6 DB36/T 13712020 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：何烈干、邹芬、马辉刚、涂玉琴、王美清、王修慧、朱跃冬、朱业斌、赖金美。DB36/T 13712020 1 马铃薯抗晚疫病鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了江西省马铃薯对晚疫病抗性鉴定的菌株选择、育苗管理、鉴定方法、病情调查和抗性评价标准等技术要求。本文件适用于江西省马铃薯品种（系）对晚疫病的抗性鉴定及评价。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18133 马铃薯种薯 GB/T 29379 马铃薯脱毒种薯贮藏、运输技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 马铃薯晚疫病 potato late blight 由疫霉属致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.)De Bary侵染马铃薯引起的一种流行性病害，具体见附录A。3.2 生理小种 physiological race 病原物种内或专化型内在形态上无差异但在寄主植物的不同品种上具有显著致病性差异的类群。3.3 接种体 inocula 用于接种以引起病害的病原物或病原物的一部分。3.4 抗性评价 evaluation of resistance levels 根据采用的技术标准判别植物对特定病害反应程度和抵抗水平的描述。DB36/T 13712020 2 4 仪器与试剂耗材 4.1 仪器 本鉴定技术规程中使用仪器包括：超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、冰箱、显微镜、移液器、烧杯、漏斗、试管、培养皿、打孔器等。4.2 试剂耗材 本鉴定技术规程中使用试剂耗材包括：燕麦片、黑麦、琼脂粉、酒精、纱布、滤纸、育苗盆、营养钵等。5 抗性鉴定 5.1 育苗 试验选在远离晚疫病发生的地带进行。供试马铃薯品种（系）选择纯度高、新鲜、无病虫、无损伤的脱毒马铃薯，将每个马铃薯品种的脱毒无菌试管苗于MS培养基中扩繁15株以上，在23 25 中光/暗(12 h/12 h)交替，光照强度为2000Lx3000Lx培养20 d后，移栽到装有蛭石混有羊粪的育苗盆或营养钵中，常规水肥管理，60d后用于接种鉴定。5.2 鉴定对照材料 试验中设对照感病品种，选用23种当地历年易感晚疫病的马铃薯品种，具体育苗管理同5.1。5.3 病原物 5.3.1 培养基的制备 黑麦培养基：取50 g黑麦种子在适量去离子水中浸泡24 h36 h，捣碎机捣碎，55 60 水浴1h2h，经2层纱布过滤，上清液补水至1L，加入琼脂粉15 g、番茄汁100 mL和碳酸钙0.1 g，121 高压蒸汽灭菌20min。5.3.2 菌株分离及鉴定 供试病原菌为从江西露地栽培马铃薯病株中采集，于黑麦培养基上分离得到，经形态学鉴定为致病疫霉并成功进行了回接，置于10冰箱中保存备用。将培养菌株接种于健康马铃薯叶片或块茎上，诱发发病并从发病部位分离获得致病疫霉菌，纯化后在显微镜下观察孢子囊形态特征等。5.3.3 生理小种选择 选择江西省马铃薯晚疫病菌23个优势生理小种进行接种。5.4 接种体制备 5.4.1 培养基的制备 燕麦培养基：燕麦片30g，琼脂20g，去离子水1000mL。将燕麦片加入600 mL去离子水中，匀浆，加热至4550，然后加入含有融化琼脂的剩余400 mL去离子水，121 高压蒸汽灭菌20 min。DB36/T 13712020 3 1%水琼脂培养基：称取10 g琼脂于990 g蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121 高压蒸汽灭菌20min，灭菌结束后摇匀，备用。5.4.2 菌株的繁殖 将马铃薯晚疫病菌菌株从保存的试管中移出活化后，置于燕麦培养基上20 黑暗培养5 d后即可用于接种，备用。5.5 取样 从马铃薯植株中部上取大小一致的健康小叶叶片进行抗性鉴定，每个品种（系）取3040片叶片。5.6 人工接种 采用离体叶片法进行接种。将所取叶片用无菌水冲洗3次，置于含1%水琼脂培养基的培养皿内，叶背朝上，用消毒过的直径为0.5 cm打孔器在菌落边缘打取菌饼，菌面朝下接种于叶片中央位置，放入18 20 的光照培养箱中黑暗培养，24 h后保持光照培养箱中光/暗(12 h/12 h)交替培养。6 病情调查 6.1 调查时间 接种后第5d进行病情调查。6.2 调查方法 观察叶片接种部位症状出现情况，调查具有典型晚疫病症状的叶片，测量其病斑面积和叶片面积，计算病斑面积占叶片面积的比率。用自制的透明方格板计算面积，每小格为0.25 cm2，计数时，叶片或病斑边缘凡超过半格的算1格，不足半格的则不计数。6.3 病情分级标准 根据分级标准记载病情，分级标准的划分详见表1。表1 马铃薯晚疫病接种鉴定分级标准 病级 病情 0 级 无病斑 1 级 病斑面积5%2 级 5%病斑面积20%3 级 20%病斑面积40%4 级 40%病斑面积60%5 级 60%病斑面积80%6 级 80%病斑面积 6.4 病情记载 按照表1所述植株的病情级别及其对应的病情描述，调查所有供试品种（系）的发病情况，记载每份品种（系）的病情级别，按公式（1）计算病情指数。病情指数（ID）=（各病级的叶片数病级数）100/（调查总叶数6）（1）DB36/T 13712020 4 7 抗性评价 7.1 鉴定有效性判别 当鉴定试验中对照感病品种叶片的发病率在60%以上时，该批次抗马铃薯晚疫病鉴定视为有效。7.2 抗性评价 根据鉴定材料3次重复病情指数的平均值确定其抗性水平，抗性划分标准见表2。表2 马铃薯抗晚疫病接种鉴定的评价标准 病情指数 抗性级别 020.0 高抗（HR）20.135.0 抗（R）35.150.0 中抗（MR）50.185.0 感（S）85.1100.0 高感（HS）8 接种后材料的处理 将鉴定后的病株及病土进行消毒处理后方可丢弃。DB36/T 13712020 5 A A 附 录 A（资料性）马铃薯晚疫病植株症状和病原菌生物学特性 A.1 植株症状 马铃薯晚疫病（Potato Late Blight）由致病疫霉引起，导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性卵菌病害。叶片染病先在叶尖或叶缘生水浸状绿褐色斑点，病斑周围具浅绿色晕圈，湿度大时病斑迅速扩大，呈褐色，并产生一圈白霉，即孢囊梗和孢子囊，尤以叶背最为明显；干燥时病斑变褐干枯，质脆易裂，不见白霉，且扩展速度减慢。茎部或叶柄染病现褐色条斑。发病严重的叶片萎垂、卷缩，终致全株黑腐，全田一片枯焦，散发出腐败气味。块茎染病初生褐色或紫褐色大块病斑，稍凹陷，病部皮下薯肉亦呈褐色，慢慢向四周扩大或烂掉。A.2 病原菌生物学特性 马铃薯晚疫病病原菌为致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.)de Bary。属于异宗配合卵菌，有A1和A2两种交配型。通常进行无性繁殖，但当A1和A2交配型同时存在时，二者可通过异宗配合进行有性生殖，产生有性生殖后代卵孢子。晚疫病菌在形态上可划分为菌丝、孢囊梗、孢子囊、游动孢子、休止孢和卵孢子。菌落白色，菌丝体由无色无隔菌丝组成，较宽，具有分支；孢囊梗节状，各节基部膨大而顶端尖细；孢子囊顶生或侧生，倒梨形或柠檬形，一端具半乳突，另端有小柄，易脱落。条件适宜时，成熟的孢子囊能产生、释放812个游动孢子。游动孢子呈卵形或肾形，侧生双鞭毛，休眠后双鞭毛收缩形成球形具有细胞壁的休止孢。休止孢萌发产生芽管，形成一个附着胞，通过表皮直接侵入寄主。卵孢子为球形，在藏卵器内，厚壁，常不满器。藏卵器为球形，壁光滑；雄器大小形状不一，围生。具有厚壁的卵孢子可抵抗不良环境，在土壤中存活6个月至3年。_
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