资源描述
ICS 65.020.20 B 04 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 843 2018 绿豆源成 分检测 定性 PCR 法 Mung bean-derived ingredients detection Qualitative PCR method 2018-11-07 发布 2018-12-01 实施 天 津 市 市 场 和 质 量 监 督 管 理 委 员 会 发布 DB12/T 843 2018 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由天 津市 农村 工作 委员会 提出 并归 口。本标准 起草 单位：天 津市 农业质 量标 准与 检测 技术 研究所、浙 江省 农业 科学 院农产 品质 量标 准 研 究所、天 津市 东丽 区产 品质 量监督 检验 所。本标准 主要 起草 人：兰青 阔、陈 笑芸、王 成、赵新、兰璞、王 永、王庆 平、汪小福、黄 凤军、秦 志扬。DB12/T 843 2018 1 绿 豆源成 分检测 定性PCR 法 1 范围 本标准 规定了 绿豆 源成分 的定性PCR 检 测方法 的 原 理、试剂 和材料、仪 器、分 析步骤、结果 分析 和表述、检出 限。本标准 适用 于绿 豆源 成分 的定性PCR 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 绿豆源 成分 特异 性序 列 specific sequence of Mung bean-derived ingredients 本标准 绿豆 源成 分特 异性 序列位 于绿 豆第5号 染色 体。4 原理 根据绿 豆源 特异 性序 列设 计特异 性引 物，对试 样进 行PCR 扩增。依 据是 否扩 增 获得预 期的DNA 片段，判断样 品中 是否 含有 绿豆 源成分。5 试剂和 材料 5.1 除非另 有说 明，仅使 用分 析纯试 剂和 重蒸 馏水 或符 合 GB/T 6682 规 定的 一级 水。5.2 1 mol/L 氢 氧化 钠溶 液：在 160 mL 水中 加入8.0 g 氢氧化 钠（NaOH），溶解 后，冷 却至 室温，再加水定 容 到200 mL。5.3 CTAB-A buffer：将4 g 十 六烷基 三甲 基溴 化胺（CTAB）、16.4 g 氯 化钠（NaCl）、3.15 g 三羟甲基氨 基甲 烷-盐酸（Tris-HCl）、1.5 g 乙二 胺四 乙 酸 二钠（EDTA-Na2）依次 加入 到 100 mL 无菌 去离子水中，用1 mol/L 氢氧 化钠溶 液（见 5.1）调 pH 至 8.0，加 水定 容至200 mL。在 103.4 kPa（121）条件下 灭 菌15 min。5.4 CTAB-B buffer：将 1 g 十 六烷基 三甲 基溴 化胺（CTAB）、0.5 g 氯 化钠（NaCl）、依次 加入 到 100 mL 无 菌去 离子 水中，用1 mol/L 氢氧 化钠 溶液（见5.1）调 pH 至8.0，加水 定容 至 200 mL。在 103.4 kPa（121）条件 下灭 菌15 min。DB12/T 843 2018 2 5.5 1.2 mmol/L NaCl 溶 液：将7 g 氯 化钠（NaCl）溶 于 100 mL 无 菌去 离子 水中。在 103.4 kPa（121）条件下 灭 菌15 min。5.6 70%乙 醇：将737 mL 95%乙醇，加水 定容 至1000 mL。5.7 500 mmol/L 乙 二胺 四乙 酸 二钠（EDTA-Na2）溶 液（pH 8.0）：称取18.6 g 乙 二胺四 乙酸 二钠，加入70 mL 水中，缓慢 滴加 氢氧化 钠溶 液（见5.1）直 至 EDTA-Na2 完 全溶 解，用 氢氧化 钠溶 液（见5.1）调pH 至8.0，加水 定容 至100 mL。在 103.4 kPa（121）条 件下 灭菌20 min。5.8 1 mol/L 三 羟甲 基氨 基甲 烷-盐酸（Tris-HCl）溶液（pH 8.0）：称 取121.1 g 三羟甲 基氨 基甲 烷溶解 于800 mL 水 中，用盐 酸调 pH 至8.0，加 水定 容 至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条 件下 灭菌20 min。5.9 TE 缓 冲液（pH 8.0）：分 别量 取10 mL 三 羟甲 基氨 基甲烷-盐 酸溶 液（见 5.7）和 2 mL 乙二 胺四乙酸二 钠溶 液（见5.6），加水 定容 至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下 灭 菌 20 min。5.10 琼脂糖。5.11 10 g/L 溴 化乙 锭（EB）溶 液：称 取 1.0 g 溴化 乙锭，溶解 于 100 mL 水 中，避 光保存。溴 化乙 锭有致癌 作用，配 制和 使用 时应戴 一次 性手 套操 作并 妥善处 理废 弃物。根 据需 要可选 择其 他效 果 相 当 的 核酸染料 代替 溴化 乙锭 作为 核酸电 泳的 染色 剂。5.12 50TAE 缓 冲液：称 取 242.2 g 三羟 甲基 氨基 甲烷（Tris），先 用500 mL 水 加 热搅拌 溶解 后，加入100 mL 乙 二胺 四乙 酸 二钠溶 液（见 5.6），用 冰乙酸 调 pH 至8.0，然 后 加水定 容 到 1 000 mL。使用时用 水稀 释 成1TAE。5.13 加样缓 冲液：称 取 250.0 mg 溴 酚蓝，加 入10 mL 水，在室 温下 溶 解12 h；称取250.0 mg 二甲基苯腈 蓝，加10 mL 水溶 解；称 取 50.0 g 蔗糖，加30 mL 水 溶解。混 合以 上三 种溶液，加 水定 容 至 100 mL，在 4 下 保存。5.14 DNA 分 子量 标准：可 以清 楚区 分 100 bp 1 000 bp 的 DNA 片段。5.15 dNTPs 混合 溶液：将 浓度 为 10 mmol/L 的dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四 种脱 氧 核糖核 苷酸 溶液 等体积混 合。5.16 Taq DNA 聚 合酶、PCR 扩 增 缓冲液 及25 mmol/L 氯化 镁（MgCl2）溶 液。5.17 绿豆源 特异 性引 物：Mungbean_470bp_F：5-TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGA-3；Mungbean_470bp_R：5-CCGCGAGTATTATTGATGGTAGG-3；预期扩 增片 段大 小 为 470 bp，参 见附 录A。5.18 引物溶 液：用 TE 缓 冲液（见5.8）或 水分 别将 上述 引物稀 释 到10 mol/L。5.19 石蜡油。5.20 DNA 提 取试 剂盒。5.21 定性PCR 试 剂盒。5.22 PCR 产 物回 收试 剂盒。6 仪器 6.1 分析天 平：重 感0.1 g 和0.1 mg。6.2 PCR 扩 增仪：升 降温 速度 1.5/s，孔 间温 度差 异 1.0。6.3 电泳槽、电 泳仪 等电 泳装 置。6.4 紫外透 射仪。6.5 凝胶成 像 系 统或 照相 系统。6.6 重蒸馏 水发 生器 或超 纯水 仪。DB12/T 843 2018 3 6.7 其他相 关仪 器和 设备。7 分析步 骤 7.1 DNA 提取 称取100 mg 样 品于2.0 mL 离心管 中，加 入300 L 无 菌去离 子水，充分 混匀；加入500 L CTAB-A buffer，充 分混匀；加 入20 L 蛋 白酶K（20 mg/mL），充 分混匀，65 水 浴1 h，间 期混 匀三次；加入20 LRNase A（10 mg/mL），充分 混匀，65 水浴10 min；16 000 g 离心10 min；转移 上清 液至 新的2.0 mL 离 心管 中，加入500 L 三氯 甲烷，混 匀30 s；16 000 g离心10 min；转移500 L上 清液 至新的2.0 mL 离 心管 中，加入500 L 三 氯甲 烷，混匀30 s；16 000 g离心5 min，转移上 清液 至新 的2.0 mL离心管 中，加 入2倍 体积的CTAB-B buffer，吹打 混匀，室温 静置60 min；16 000 g 离心5 min，弃 上清液；沉 淀中 加入350 L 1.2 mmol/L NaCl，再 加入350 L 三氯 甲 烷，混 匀30 s；16 000 g离心10 min，转移上 清液至 新的 洁净2.0 mL 离心 管中；加入0.6倍 体积的 异丙醇，充 分混匀；16 000 g离心10 min，弃上清 液；加 入500 L 70%乙醇，颠倒 混匀；16 000 g 离心10 min，弃 上清 液；室温 静置至 管内 水分完全蒸 发，加入100 L 无 菌去离 子水 溶解 沉淀，所 得溶液 即为 绿豆DNA，-20 贮存 备用。7.2 DNA 的 浓度 和质 量 将DNA 适当 稀释 或浓 缩，使 其OD260值在0.1 0.8 的 区 间内，测定 并记 录其 在260 nm 和280 nm 的 吸光度。以1个OD260 值相 当于50 mg/L DNA 浓度 来计 算纯 化DNA 的浓 度，并进 行DNA 凝胶电 泳检 测DNA 完 整性。DNA溶 液的OD260/OD280 值 应在1.7 2.0 之 间，或质 量能复 合检 测要 求。7.3 PCR 扩增 7.3.1 试样PCR 反应 7.3.1.1 每一个 试 样PCR 反应 设 置3 次重 复。7.3.1.2 在PCR 反应 管中 按附 录 B 依次加 入反 应试 剂，混匀，再 加 25 L 石蜡 油（有 热盖设 备 的 PCR仪可不 加）。7.3.1.3 将PCR 管放 在离 心机 上，500 g 3000 g 离心 10 s，然后取 出PCR 管，放 入 PCR 仪中。7.3.1.4 进行PCR 扩 增。反应 程序 为：94 预变 性 5 min；94 变 性30 s，58 退 火30s，72 延伸30 s，共进 行35 次循 环，72 延伸 7 min。（可根 据仪 器和 试剂 要求 对反应 参数 作适 当调 整。）7.3.1.5 反应结 束后 取 出 PCR 管，对PCR 产物 进行 电泳 检测。7.3.2 对照PCR 扩增 7.3.2.1 在试 样PCR 扩增 的同 时，应设置 阴性 对照、阳 性对 照和空 白对 照。7.3.2.2 以绿豆 材料 提取 的 DNA 作 为阳性 对照；以 非绿 豆材 料DNA 作为 阴性 对照；以 水作为 空 白 对 照。7.3.2.3 除模板 外，其余 组分 与 PCR 扩增 与7.2.1 相同。7.4 PCR 产物 电泳 检测 按20 g/L 的 质量 浓度 称取 琼脂糖，加 入1 TAE 缓冲 液中，加热 溶解，配 制成 琼脂糖 溶液，每100 mL琼脂糖 溶液 中加 入5 L EB 溶液，混匀，稍适 冷却 后，将其 倒入 电泳 板上，插 上梳板，室 温下 凝固 合成凝胶后，放入1TAE 缓冲 液中，垂直向 上轻 轻拔去 梳板。取12 L PCR产物与3 L 加样 缓冲液 混合 后加入凝 胶点样 孔，同时在 其中一 个点样 空中 加入DNA 分子量 标准，接通 电源在2 V/cm 5 V/cm 条 件下电泳检测。DB12/T 843 2018 4 7.5 凝胶成 像分 析 电泳结 束后，取出 琼脂糖 凝胶，置于凝 胶成 像仪上 或紫外 透射仪 上成 像。根 据DNA分 子量 标准 估 计扩增条 带的大 小，将电泳 结果形 成电子 文档 存档或 用照相 系统拍 照。如需通 过序列 分析确 认PCR扩增片段是否 为目 的DNA 片 段，按 照7.5 和7.6 的规 定执 行。7.6 PCR 产 物回 收 按PCR 产物 回收 试剂 盒说 明 书，回 收PCR 扩 增的DNA 片 段。7.7 PCR 产 物测 序验 证 将回收 的PCR 产 物克 隆测 序，与绿 豆源 成分 特异 性序 列（参 见附 录A）进 行对 比，确定PCR 扩增 的DNA片段是 否为 目的DNA 片段。8 结果分 析和 表述 8.1 PCR 扩 增产 物电 泳检 测结 果 绿豆源 成分 的PCR 扩 增产 物 大小为470 bp，参 见 附录A。8.2 结果表 述 在符合 绿豆 源成 分的PCR 产 物大小 为470 bp 的情 况下，被检 样品 进行 检测 时：PCR 扩 增产 物电 泳 检 测结 果阴性 者判 为不 含绿 豆源 成分，表述 为“未检 出绿 豆源成 分”；PCR 扩 增产 物电 泳检 测结 果阳性 者判 为含 有绿 豆源 成分，表述 为“检出 绿豆 源成分”。9 检出限 本标准 方法 的检 出限 为1%（含靶 序列 样品DNA/总样 品DNA）。DB12/T 843 2018 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）绿豆源 成分 特异 性序 列 1 TGAATGAGAG TGGTGTGAGT GAGAATAACA ATCCAAGTGG CAGTCTTAAC TATGAACACA 61 GACAAGGAAG CAAAGTAGCA ATGATATAAA ATGTTCAGAA TCAAATTGCA GAATCCATTA 121 ATAAAATTTT GTAATGCAGA AGTAAGGAAA AAGTAATGTG TCCATAACAC TATCCTTGCG 181 CTCATACTAG CTCCCCAATT TGTTTGCCTC ATGCTATTAT TGATCAACTA CCTTATATTC 241 AATTCAATTC TAGATTGTAA GCACTTAAAA AATCAAGAAT CTAAGAAAAC AAATGCTGCA 301 ATGCAACCTC AACTGAAGGT AGTACAAACA GGATTGAGAA AAAGAGAGCA ACAAAATAAG 361 AAAAAAAAGG CATAAAGAAA GTTAGCCAGT TATCATAGTT CCAGCACCTT CATCAGTTAA 421AATCTCGAGC AACAAAGAGT GAGGAACCCT ACCATCAATA ATACTCGCGG 注：划线部分为Mungbean_470bp_F 和Mungbean_470bp_R 引物序列。DB12/T 843 2018 6 B B 附 录 B（资料 性附 录）PCR 检 测反 应体 系 PCR 检 测反 应体 系见表B.1。表B.1 PCR 检测 反 应体 系 试剂 终浓度 体积 ddH2O 10 PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L 上游引物 0.4 mol/L 1 L 10 mol/L 下游引物 0.4 mol/L 1 L Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA 模板 2.0 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 注1：“”表 示 体积 不 确 定，如 果PCR 缓冲 液 中 含有 氯 化 镁，则 不加 氯 化 镁 溶 液，根 据Taq DNA 聚合 酶 的 浓 度 确定其体积，并相应调整ddH2O 的体 积，使反应体系总体积达到25.0 L。注2：若采用定性PCR 试剂盒，则按试 剂盒说明书的推荐用量配制反应体系。_
展开阅读全文