黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期检测技术规程DB32／T 3487-2018.pdf

I C S 6 5.0 2 0.2 0B 1 6备 案 号：江 苏 省 地 方 标 准DB32D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 8黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 苗 期 检 测 技 术 规 程T e c h n i c a l S p e c i f i c a t i o n f o r t h e S e e d l i n g D e t e c t i o n o f C u c u m b e r G r e e n M o t t l eM o s a i c V i r u s2 0 1 8-1 1-9 发 布 2 0 1 8-1 1-3 0 实 施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 8I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1 2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 及 编 写 的 规 定 编 写。本 标 准 由 江 苏 省 农 业 科 学 院 提 出 并 归 口。本 标 准 起 草 单 位：江 苏 省 农 业 科 学 院。本 标 准 主 要 起 草 人：程 兆 榜、任 春 梅、季 英 华、杨 柳、缪 倩、周 益 军。D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 81黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 苗 期 检 测 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 苗 床 期 瓜 苗 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 的 检 测 条 件、检 测 技 术、结 果 判 定 和 结 果 记 载。本 标 准 适 用 于 苗 床 期 症 状 尚 未 表 现 的 瓜 类 作 物 上 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 的 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 3 5 3 3 5 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 病 监 测 规 范S N/T 2 9 6 4 植 物 病 毒 检 测 规 范3 检 测 条 件3.1 主 要 试 剂磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4）、磷 酸 二 氢 钾（K H 2 P O 4）、氯 化 钾（K C l）、氢 氧 化 钠（N a O H）、碳 酸 氢 二钠（N a 2 H C O 3）、氯 化 钠（N a C l）、叠 氮 化 钠（N a N 3）、P V P-4 0 0、鸡 卵 清 蛋 白、无 水 亚 硫 酸 钠（N a 2 S O 3）、吐 温-2 0、焦 碳 酸 二 乙 酯（D E P C）、溴 百 里 酚 蓝、乙 二 醇、T r i s 碱、T r i s-H C l、硼 酸、E D T A、无 水 乙 醇、琼 脂 糖、D I G D N A L a b e l i n g K i t、C G M M V 抗 体。P C R 试 剂 和 检 测 过 程 中 所 需 溶 液 配 方，参 见 附 录 A。除 另 有 规 定 外，所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂。3.2 用 具 及 仪 器用 具 耗 材：移 液 器、一 次 性 手 套、牛 皮 纸 袋、标 签 纸、记 号 笔 等仪 器 设 备：高 压 灭 菌 锅、培 养 箱、高 速 冷 冻 离 心 机（规 格：-6 2 0、最 高 转 速 1 2 0 0 0 转/分 以 上）、电 泳 仪（规 格：电 压 5 0 1 2 0 V、电 流 1 0 8 0 0 m A）、P C R 仪、凝 胶 成 像 系 统、超 纯 水 仪。4 检 测 技 术4.1 采 样 方 法4.1.1 采 样 时 间待 检 材 料 为 嫁 接 或 未 嫁 接 的 黄 瓜、西 瓜、甜 瓜、南 瓜 等 瓜 类 作 物 幼 苗，采 样 时 间 为 出 厂 定 植 前 3天 7 天 植 株 处 于 2 片 4 片 真 叶 期。4.1.2 采 样 部 位植 株 最 上 部 半 展 开-展 开 的 心 叶，心 叶 未 达 要 求 时 取 位 于 心 叶 下 部 一 张 完 全 展 开 叶。4.1.3 取 样 方 法五 点 法 取 样，一 株 为 一 个 样 本，不 同 品 种 或 同 一 品 种 不 同 时 间 播 种 的 为 不 同 批 次，每 批 次 样 本 数 量不 小 于 2 0 0 株 或 同 批 次 苗 的 0.1%。样 本 采 集 时 使 用 一 次 性 手 套 单 株 采 集 并 临 时 保 存 在 一 次 性 手 套 中。D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 824.1.4 样 品 处 置取 样 后 叶 片 一 分 为 二，一 半 为 检 测 样 品、一 半 为 留 存 样 品。样 品 用 吸 水 纸 包 裹 置 于 透 气 牛 皮 纸 袋 中，新 鲜 检 测 样 品 在 4 下 临 时 保 存 3 天 内 检 测 完 毕，如 不 能 在 3 天 内 检 测 则 将 样 品 于-2 0 的 条 件 下 冰 冻保 存。留 存 样 品 室 温 下 荫 干-2 0 的 条 件 下 冰 冻 保 存 一 年 后，确 认 不 再 需 要 时 焚 烧 或 深 埋 处 置。4.2 检 测 方 法4.2.1 样 品 处 理称 取 0.1 g 待 检 样 品 叶 片，加 入 适 量 液 氮 充 分 研 磨 成 粉 末 后 加 入 1 0 倍 体 积 的 通 用 样 品 处 理 缓 冲 液（见附 录 A）溶 解，1 0 0 0 0 转/分 离 心 5 分 钟，上 清 即 为 样 品 提 取 液。同 一 批 样 品 中 加 入 具 典 型 斑 驳 花 叶 症 状并 经 P C R 法 鉴 定 确 认 为 C G M M V 的 病 样 稀 释 1 0 0 0 倍 为 阳 性 对 照、经 P C R 法 确 认 无 C G M M V 的 健 康叶 片 为 阴 性 对 照。4.2.2 免 疫 捕 获4.2.2.1 用 碳 酸 盐 包 被 缓 冲 液（见 附 录 A）稀 释 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 的 抗 血 清 5 0 0 倍，取 稀 释 后 的 抗 血清 3 0 L 包 被 P C R 管，4 孵 育 过 夜 或 3 7 下 放 置 2 h。4.2.2.2 弃 包 被 缓 冲 液，用 洗 涤 缓 冲 液（见 附 录 A）洗 涤 3 次 4 次，加 入 5 0 L 样 品 提 取 液，3 7 孵 育2 h。4.2.2.3 弃 样 品 提 取 液，用 洗 涤 缓 冲 液 洗 涤 3 次 4 次，再 用 无 菌 去 离 子 水 洗 一 次，吸 尽 管 底 余 液 后 直 接在 包 被 了 病 毒 的 P C R 管 中 进 行 反 转 录。4.2.3 反 转 录4.2.3.1 C G M M V 特 异 性 引 物 的 设 计 及 合 成 根 据 C G M M V 分 离 物（G e n b a n k 序 列 号 D Q 2 1 7 7 7 8）序 列设 计 一 对 用 于 扩 增 C G M M V-c p 基 因 的 特 异 性 引 物：F:5-A T G G C T T A C A A T C C G A T C A C-3；R:5-T G G G C C C C T A C C C G G G G A A A A G-3，-2 0 保 存。4.2.3.2 反 转 录 体 系 及 操 作 在 免 疫 捕 获 后 的 C R 管 中 加 入 C G M M V 3 端 引 物 1 L，D E P C 水 9 L，6 5 变 性 5 m i n，取 出 置 于 冰 上 5 m i n，再 依 次 加 入 下 列 试 剂：5 M-M u L V 反 转 录 酶 缓 冲 液 2 L，4 0m m o l/L d N T P s（每 种 1 0 m m o l/L）0.5 L，R N a s i n（4 0 U/L）0.5 L，M-M u L V 反 转 录 酶（2 0 U/L）0.5 L，4 2 水 浴 1 h，7 0 灭 活 1 0 m i n，-2 0 保 存 备 用。管，参 照 N Y/T 2 2 8 8-2 0 1 2 中 7.4 的 要 求 进 行，并 略 有 改 进。具 体 操 作 参 见 附 录 B。4.2.4 P C R以 反 转 录 合 成 的 c D N A 第 一 条 链 为 模 板，进 行 P C R 扩 增，扩 增 反 应 体 系 2 5 L。2 5 L P C R 标 准 反 应 体 系：1 0 T a q P C R B u f f e r(W i t h M g2+)2.5 L，4 0 m m o l/L d N T P s（每 种 1 0m m o l/L）0.5 L，T a q D N A P o l y m e r a s e(5 u/u l)0.5 L，C G M M V 上 游 引 物（1 0 m o l/L）0.5 L，C G M M V下 游 引 物（1 0 m o l/L）0.5 L，c D N A 3 L 和 D E P C 水 1 7.5 L。P C R 反 应 程 序：9 4 预 变 性 5 m i n；9 4 变 性 5 0 s，5 3 退 火 5 0 s，7 2 延 伸 1 m i n，循 环 3 0 次；7 2 延 伸 1 0 m i n。上 述 P C R 结 束 后，每 个 P C R 管 中 取 出 1 L 加 入 新 P C R 管 中，采 用 同 样 的 2 5 L P C R 标 准 反 应 体系 和 P C R 反 应 程 序 再 次 进 行 P C R 扩 增。5 结 果 判 定7.1 电 泳 检 测配 制 1%琼 脂 糖 凝 胶，将 P C R 产 物 3 L 与 上 样 缓 冲 液 3 L 混 合 加 入 样 品 孔 中，1 0 0 V 电 泳 3 0 分 钟。核 酸 染 料 染 色 1 5 m i n，凝 胶 成 像 系 统 拍 照 观 察。D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 837.2 结 果 判 定观 察 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳（参 见 附 录 B）结 果，阳 性 对 照 在 6 6 0 b p 处 有 条 带 出 现，且 阴 性 对 照 无 条 带出 现 的 前 提 下，待 测 样 品 在 6 6 0 b p 处 有 条 带 出 现，即 可 判 定 样 品 携 带 C G M M V；否 则 为 阴 性 反 应，即样 品 不 携 带 C G M M V。当 样 品 检 测 为 阳 性 时，按 G B/T 3 5 3 3 5 规 定 执 行。8 结 果 记 载将 实 验 室 检 测 鉴 定 结 果 记 载 于 表 1（瓜 苗 携 带 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 检 测 结 果 记 录 表）（见 附 录 B），记 录 保 存 1 年 以 上。D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 84附 录 A(资 料 性 附 录)试 剂 及 配 制 方 法A.1 免 疫 捕 获 缓 冲 液A.1.1 洗 涤 缓 冲 液（W a s h B u f f e r,0.0 1 M P B S T)称 取 8 g N a C l、0.2 g K C l、0.2 g K H 2 P O 4、3 g N a 2 H P O 4 溶 化 于 8 0 0 m L 无 菌 去 离 子 水 中，再 加 入0.5 m L T w e e n-2 0 定 溶 于 1 0 0 0 m L，即 为 0.0 1 M P B S T，4 保 存。A.1.2 通 用 样 品 处 理 缓 冲 液（G e n e r a l E x t r a c t B u f f e r）称 取 2 g 鸡 卵 清 蛋 白，1.3 g 无 水 亚 硫 酸 钠，2 0 g P V P-4 0 0 和 0.2 g 叠 氮 化 钠，加 入 1 0 0 0 m L A.1.1所 述 0.0 1 M P B S T 中，再 加 入 1 0 m L T w e e n-2 0，4 保 存。A.1.3 碳 酸 盐 包 被 缓 冲 液（C o a t i n g b u f f e r,0.5 M)称 取 1.5 9 g 无 水 N a 2 C O 3 和 2.9 3 g N a H C O 3，加 水 定 容 至 1 0 0 0 m L，用 H C l 调 节 p H 值 至 9.6，4 保 存。A.2 R T-P C R 试 剂A.2.1 R T-P C R 分 子 试 剂T a q D N A 聚 合 酶、d N T P、购 自 大 连 宝 生 物 公 司。反 转 录 酶 M-M L V、R N A 酶 抑 制 剂 购 自 P r o m e g a公 司，-7 0 保 存。A.2.2 电 泳 缓 冲 液 T B E在 1 0 0 0 m L 去 离 子 水 中 加 入 T r i s 碱 5 4 g、硼 酸 2 7.5 g、2 0 m L 0.5 M E D T A（p H 8.0），使 用 时 利 用 去离 子 水 1 0 倍 稀 释，即 为 0.5 T B E。A.2.3 琼 脂 糖 凝 胶在 0.5 T B E 工 作 液 中 加 入 1%(w/v)的 琼 脂 糖，融 化，冷 却 至 6 0 倒 入 插 入 梳 子 的 制 胶 槽 中，冷 却凝 固 后 点 样 电 泳。A.2.4 上 样 缓 冲 液取 溴 百 里 酚 蓝 0.0 2 5 g，乙 二 醇 3 g，加 1 0 m L 蒸 馏 水。D B 3 2/T 3 4 8 7 2 0 1 85附 录 B(资 料 性 附 录)检 测 结 果 记 载 表表 1 瓜 苗 携 带 黄 瓜 绿 斑 驳 花 叶 病 毒 检 测 结 果 记 录 表样品采集日期样品采集地点样品种类与名称测定样品数量（株）第一次P C R 结果 第 二 次 P C R 结 果鉴定技术负责人 阳性样品数（株）阴性样品数（株）带毒株率(%)阳性样品数（株）阴性样品数（株）带毒株率(%)