水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光RT-PCR法DB45／T 2138-2020.pdf

ICS 1 1.02 0 C 51 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 21382020 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光 RT-PCR 法 Detection of norovirus nucleotide acid in water Real-time RT-PCR 2020-07-24 发布 2020-08-20 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 2 13 8 20 20 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区卫生健康委员会提出并宣贯。本标准由广西壮族自治区卫生技术标准委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心。本标准主要起草人：刘巍、邓丽丽、谭冬梅、马宇燕、钟革、李秀桂。1 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-P C R检测方法。本标准适用于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水、污水等水体中基因组和基因 组诺如病毒的检测。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 诺如病毒 No ro vi ru s 世界范围内引起急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体。大多数诺如病毒引起的水源性暴发疫情是由 于饮用水或生活用水被污染所致。诺如病毒属于人类杯状病毒科的诺如病毒属，是一组形态相似、抗原 性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径 26 nm 35 n m，无包 膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺 如病毒基因组是单股正链 RN A，全 长 7.5 k b7.7 kb，根据 基因特征，诺如病毒被分为 6 个基 因组（ge no gr ou p，），和是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因组，也可感染人，但很少被检出。2.2 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应 Re al-t im e RT-PC R 在RT-PC R反应体系中加 入荧光基团，利用荧光 信号累积实 时监测整个P CR进程，最后通过Ct值对模 板进行定性。2.3 C t 值 C yc le th re sh ol d v al ue 每个PCR反应 管内荧光信 号到达设定 的域值时所 经历的循环 数。各模板 的Ct值与该模板的起始拷 贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。反之亦然。3 原理 水样在通过带负离子混合纤维素膜时，带正离子的病毒被吸附到膜上，然后再洗脱病毒，并用聚乙 二醇沉淀病 毒达到富集 浓缩的效果。应用实时 荧光RT-PCR 技术，针对 诺如病毒衣 壳蛋白区N/S 区设计特 异性引物和探针，荧 光 探针的5端 标记报告荧光基团，3端 标记淬灭荧光基团，当探针完整时，报告 荧光基团的发射波长被淬灭荧光基团的激发波长吸收；当PCR扩增时，T aq酶的5 3 端外切酶活性将 探针酶切水解，报告荧光不再受淬灭荧光的影响，使荧光监测系统收集到报告基团的荧光信号，即每扩 增一条DNA 链，可 产生一个报告基团的荧光信号，实现荧光信号积累与PC R 产物形成 同步。4 试剂和耗材 4.1 试剂 4.1.1 除另有说明外，本文件所使用的试剂均为分析纯，分子生物学试剂所用水为无 RN A 酶的水。DB 45/T 2 03 8 20 20 2 4.1.2 2.5 mo l/L氯 化 镁（M gC l 2）溶液，配 制 遵 照 附录 A中 的A.1 执 行。4.1.3 3 牛肉浸膏 洗脱液，配 制 遵 照 附录 A中 的A.2 执 行。4.1.4 16 P E G 8 00 0 溶液，配 制 遵 照 附录 A中 的A.3 执 行。4.1.5 0.2 mo l/L 的N a 2 H P O 4 溶液，配 制 遵 照 附录 A中 的A.4执 行。4.1.6 1 mo l/L盐 酸 溶 液、1 mo l/L 氢氧化钠溶 液、RN A 提 取试剂盒、实时荧光 RT-P C R 试剂盒。4.1.7 引 物 和 探针。工作浓度均 为1 0 mo l/L，-2 0 保 存，引 物 和 探针序 列 见 表1。表1 实时荧光引物和探针序列表 基因组 引物/探针 序列 G JJV1F(上游引物)5-GCCATGTTCCGITGGATG-3 JJV1R(下游引物)5-TCCTTAGACGCCATCATCAT-3 JJV1P(探针)5-FAM-TGTGGACAGGAGATCGCAATCTC-BHQ-3 G JJV2F(上游引物)5-CAAGAGTCAATGTTTAGGTGGATGAG-3 COG2R(下游引物)5-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3 RING2(探针)5-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ-3 4.2 耗材 包 括以 下 物品：混合硝酸纤维素 膜，孔 径0.4 5 m；快速 定性 滤纸；离 心管，1.5 m L、5 0 m L；0.2 m L透 明 薄 壁 PC R 管。5 仪器设备 包 括以 下 物品：电子天平，精度 0.01 g；高速台 式 冷冻离 心 机，可控 温至 4，离 心 速度 13 00 0 g；水过 滤装置；正 压力泵；振荡混匀器；高压灭菌器；实时荧光 PC R 扩增仪；二 级 生 物安 全 柜。6 检测流程 见图 1。DB 45/T 2 13 8 20 20 3 图1 水体中诺如病毒的核酸检测流程 7 水样前处理 7.1 水样运送与保存 运输过程中保持水 样温度在0 5。实验室接到水样 后应48 h 内进行 检测。如未及时检测，应将水样置于-80 冰柜保 存待检。7.2 病毒富集浓缩 7.2.1 水过滤装置、剪刀、镊子等高压灭菌备用。7.2.2 1 L 水样中掺 入1 0 L 商品 化 的过程控制病毒，加入 2 0 mL 的2.5 mo l/L 氯化 镁溶液，再用1 mo l/L 盐酸调节水样 p H至3.0 0.5。如为 混浊度较大或杂质较多的水样,需预 先将水样于 4、3 50 0 g 离心 30 mi n，取上 清。7.2.3 组装水过滤装置，并 与 正压力泵连接。启动正 压力泵，使 水样缓慢通过孔径为 0.4 5 m的 混合 硝酸纤维素膜，如为浊度较大或杂质较多的水样，可 增加一层快速定性滤纸于混合硝酸纤维素膜上，然 后用镊子将硝酸纤维素膜取出，剪碎成边长0.5 cm的 小方块，放入预先装有1 0 mL 的3 牛肉膏 洗脱液 及 2颗 小玻 璃珠的5 0 m L离 心管中。7.2.4 用振荡混匀器振荡 20 mi n3 0 m in，取上清液转移至干净的5 0 m L离 心管 中。7.2.5 加入等体积的 16 P EG 8 00 0 溶液，振荡 充 分混匀，调节 p H 值 至 7.0，4 静置 2 h3 h。7.2.6 4、1 0 00 0 g 离心5 m in，弃上清后，将 50 m L离 心管中的溶液全部倾倒在干净的滤纸上。7.2.7 加1 0 0 L2 00 L 的 0.2 mo l/L N a 2 H PO 4，振荡，直 至完全重悬沉淀。7.2.8 4、1 0 00 0 g 离心5 m in，取上清即为病毒浓缩液。剪碎滤膜+牛肉浸 膏洗脱液 上清液+P EG 80 00 溶液 沉淀+2 00 L N a 2 HP O 4 病毒浓缩液 病毒RNA 提取 实时荧光 RT-PC R 过滤 振荡洗脱 203 0 mi n 4 静置 2 3 h 4，10 0 00 g 离心 5 mi n 剧烈振荡 5 m in 至 重悬沉淀 4，10 0 00 g 离心 5 mi n，取上清 1 L 水样+过程控制 病毒+氯化镁溶液 DB 45/T 2 03 8 20 20 4 8 实时荧光 R T-P CR 检测 8.1 病毒 R NA 提取 8.1.1 使 用病毒 RN A 提 取试剂盒 进行 RN A 的 提 取，可根据 仪器 和 试剂盒 要 求调 整 操作步骤。以 诺如病 毒 阳 性的 粪便悬液样 本或 商品化 的诺如病毒 样 本为 核酸 提 取 过程 阳 性对照，以双蒸 水 作 为 核酸 提 取 过程 阴 性对照。8.1.2 将 病毒 浓缩液 加入预 先装 有5 6 0 L 裂解液 的1.5 m L离 心管中，混匀，室温放置 10 m i n，再 加 入56 0 L 无水 乙醇，混匀。8.1.3 取 65 0 L 混合 液 加入到 纯化柱上，8 00 0 g 离 心1 m i n 弃收 集管 中的 离 心 液。8.1.4 将 1.5 m L离 心管中 剩余 的 混合液 全 部 加入到 纯化柱 的 上，8 00 0 g 离 心1 m i n，弃离 心 液。8.1.5 于 纯化柱上 加入51 0 L 洗 液 1，8 00 0 g 离 心1 m i n，弃离 心 液。8.1.6 于 纯化柱上 加入51 0 L 洗 液 2，1 3 00 0 g 离 心 1 m i n，弃离 心 液。8.1.7 更换新 的 收 集管，13 00 0 g 离 心1 m i n。8.1.8 将纯化柱放置 到 干净 的1.5 m L离 心管 上，向柱 中心加入35 L R NA 洗脱液，室温放置 5 m i n。8.1.9 8 00 0 g 离 心1 m i n，离 心管 收 集到的 液 体 即 为 R NA。8.1.10 所用实 验 用 具及溶液 应无 RN A 酶，操作 过程中应 佩戴 一 次 性 橡胶 或 乳胶 手套。提 取 后的 RN A 如无法 立 即 检测，应 放 在-8 0 冰 箱 保存待 检。8.2 提取效率计算 8.2.1 以 水 样 中过程控制病毒 R NA 的提 取效 率 表 示 水 样 中诺如病毒 R NA 的提 取效 率，作 为病毒 富 集 浓 缩及 病毒 RN A 提 取 的过程 控制。8.2.2 过程控制病毒按 试剂盒说明 书 提 取 R NA 后，进 行 10 倍梯 度 稀释 至 10-4或1 0-5。8.2.3 每个 稀释 度 分 别 取 5 L 加入到 含 有检测过程控制病毒的引 物 和 探针 的反应体系中，采 用 与 检 测诺如病毒相同的实时荧光 RT-P C R 反应 参 数，进行实时荧光 R T-PC R 反应，确 定 未 稀释 和 梯 度 稀释 过程 控制病毒 RN A 的 Ct 值。8.2.4 以未 稀释 和 梯 度 稀释 过程控制病毒 R NA 的 浓度 l g值 为 X轴，以 其 Ct 值 为 Y轴，建立 标准 曲 线；标准 曲 线 r 2 0.9 8。未 稀释 过程控制病毒 RN A 浓度 为1，梯 度 稀释 过程控制 RN A 浓度 分 别 为1 0-1、1 0-2、10-3、1 0-4等。8.2.5 将掺 有过程控制病毒的水 样 RN A，加 入到 含 有检测过程控制病毒引 物 和 探针 的反应体系中，采 用 与 检测诺如病毒相同的实时荧光 R T-PC R 反应 参 数，进行实时荧光 RT-P C R 反应，确 定C t值，代 入标 准 曲 线，计 算 经过病毒 富 集 浓缩及 RN A 提 取步骤 后的过程控制病毒 RN A 浓度。8.2.6 提 取效 率 计 算 见 式（1）：()%100=c b a.(1)式中：a 提 取效 率；b 经病毒 富 集 浓缩及 R NA提 取步骤 后的过程控制病毒RN A 浓度；c 未 稀释 过程控制病毒RN A 浓度。DB 45/T 2 13 8 20 20 5 8.3 实时荧光 R T-P CR 反应体系 检测水样中 诺如病毒的 实时荧光RT-PCR反应体系 见表2。反应 体系中各试 剂的量可根 据具体情况 或 不同的反应总体积进行适当的调整，可采用Real-t i me RT-P C R一 步法或两 步法试剂盒。以诺如病毒阳性 RN A为实时荧 光RT-P CR反 应 阳性对照，以不加任何RN A作为实 时荧光RT-P C R反应 空白对 照。表2 实时荧光 R T-P CR 反应体系 试剂 贮液浓度 终浓度 容积 G G RT-PCR 反应液 2 1 12.5 L 12.5 L 上游引物 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 L 0.5 L 下游引物 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 L 0.5 L 探针 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 L 0.5 L 逆转录酶-Taq 酶混合液-0.5 L 0.5 L RNA 模板-5 L 5 L 无 RNA 酶水-补足至 25 L 补足至 25 L 注：上述反应体系为参考体系，可根据选用的试剂盒说明书作适当的调整。8.4 实时荧光 R T-P CR 反应参数 逆转录50、3 0 m in；预 变性95、2 mi n；变性95、1 5 s，退火、延伸及采集荧光6 0、3 0 s，45个循环。荧光检测通道为FA M。注：根据不同仪器和试剂要求可将反应参数作适当的调整。9 结果判定与表述 9.1 质量控制 9.1.1 核酸提取过程阳性对照和 Re al-t ime RT-P CR 反 应 阳性对照，C t 值3 8；核 酸提取过程阴性对 照和 Re al-t i me R T-PCR 反应 空白对照，Ct 值 38 或未检测到荧光信号；上 述指标均成立时，说明实验 成立，有一项或以上不符合者，应重新实验。9.1.2 同时提取效率需满足1，诺如病毒检测结果成立。如提取效率1，诺如病毒检测结果为 阴性时，应重新实验；如提取效率1，但诺 如病毒检测结果为阳性时，仍可判定为阳性。9.2 结果判定 待测标 本的 C t 值 38 时，则判 定该待测标本为诺如病毒核酸检测阳性。待测标本的 C t 值 45或未检测到荧光信号时，则判定该待测标本为诺如病毒核酸检测阴性。待测标本 38 Ct 值 4 5时，应 重新检测，若重新检测的 Ct 值 3 8 时，则 判定该待测标本为诺如病毒核酸检测阳性；若重新检测的 Ct 值38 或未 检测到荧光信号时，则判定该待测标本为诺如病毒核酸检测阴性。9.3 结果表述 该待测样本经检测为或诺如病毒核酸阳性；该待测样本经检测为或诺如病毒核酸 阴性。DB 45/T 2 03 8 20 20 6 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 2.5 mo l/L氯化镁（M gC l 2 6 H 2 O）溶液 取 50 8.3 g 氯化 镁（M gC l 2 6 H 2 O），搅拌 溶解 于 超 纯 水中，用 超 纯 水定 容 至 1 00 0 m L，分 装，121 高压灭菌 15 m i n，备 用。A.2 3牛内浸膏洗脱液（p H 9.0）取 30.0 g 牛肉 浸膏，搅拌 溶解 于 超 纯 水中，调节 p H至 9.0，用 超 纯 水定 容 至 1 00 0 m L，分 装，12 1 高压灭菌 15 m i n，备 用。A.3 1 6P EG 80 00 溶液（含 0.3 mo l/L Na Cl）取 16 0.0 g P E G 8 00 0和1 7.5 g N a C l，搅拌 溶解 于 超 纯 水中，用 超 纯 水定 容 至 1 00 0 m L，分 装，12 1 高压灭菌 15 m i n，备 用。A.4 0.2 mo l/L的Na 2 HP O 4 溶液（p H 9.0）取 71.6 g N a 2 H P O 4 12 H 2 O，搅拌 溶解 于 超 纯 水中，调节 p H至 9.0，用 超 纯 水定 容 至 1 00 0 m L，分 装，12 1 高压灭菌 15 m i n，备 用。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光 RT-PCR 法 DB 45/T 2138 2020 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究