非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范DB37／T 4032—2020.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4032 2020 非洲猪瘟 恒温扩增 检测技术 规范 Technical specification for isothermal amplification detection of African swine fever 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4032 2020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东师范大学、中国动物卫生与流行病学中心、山东鼎科检测技术有限公司、潍坊安普未来生物科技有限公司、上海基灵生物科技有限公司、潍坊汉森生物饲料科技有限公司。本标准主要起草人：孙文博、吴家强、陈蕾、殷斌、陈智、吴晓东、蒋文明、刘国宪、郑乾坤、李敏、杜以军、于江、时建立、吴香菊、李俊、丛晓燕、郭立辉。DB37/T 4032 2020 1 非 洲猪瘟 恒温扩增 检测技 术规范 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒（ASFV），英文缩略表见附录D，核酸的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测技术的要求。本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下开始扩增。4 试剂或 材料 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1 水：GB/T 6682，一级水。4.2 1PBS 溶液(pH值7.4)：配制见附录A.1。4.3 核酸提取试剂：a)蛋白酶K溶液（20 mg/mL）：配制见附录A.2；b)10%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）：配制见附录 A.3；c)Tris平衡酚；d)三氯甲烷；e)70%乙醇：配制见附录 A.4。4.4 重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒。4.5 DEPC水。4.6 恒温扩增检测的引物：恒温扩增检测引物见附录 B.1。4.7 无水乙醇。4.8 微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9 离心管：1.5 mL。5 主要仪 器设 备 DB37/T 4032 2020 2 5.1 微量移液器：最大量程分别为 10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.2 生物安全柜。5.3 普通冰箱。5.4 涡旋振荡器。5.5 研磨管。5.6 荧光定量PCR 仪：Peltier 加热，16 孔（0.2 mL，28联管和单管）。5.7 电子天平：感量为0.001 g。5.8 低温高速台式离心机：离心力8 000 g。6 样品 6.1 基本要 求 应符合GB 194892008和NY/T 5412016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。6.2 样品采 集 6.2.1 棉拭子 样品 无菌操作，采集猪口腔拭子。6.2.2 组织样 品 无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2 8 低温运至实验室。6.2.3 环境样 品 相关场所的粪便、饲料、污水样品。2 8 低温运至实验室。6.3 样品处 理 6.3.1 口腔拭 子样 品处 理 口腔拭子管6 000 r/min震荡45 s，取200 L进行核酸提取。6.3.2 脾、肺、肾 等组 织样 品处 理 取0.05 g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10%的组织匀浆液，5 000 g离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.3 粪便、饲料 样品 处理 取1 g粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 r/min震荡研磨45 s，制成约10%的匀浆液，5 000 g离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.4 污水样 品处 理 取200 L污水进行核酸提取。7 操作步 骤 DB37/T 4032 2020 3 7.1 取6.2处理后的样品 500 L 加入 10%SDS 溶液 50 L、20 mg/mL蛋白酶K 溶液 10 L，于 55 水浴2 h3 h。7.2 加入200 L Tris平衡酚，混匀，4 12 000 g离心15 min。7.3 取上清液500 L，加入200 L Tris平衡酚和200 L三氯甲烷，4 12 000 g离心 15 min。7.4 取上清液400 L，加入200 L三氯甲烷，4 12 000 g 离心 15 min。7.5 取上清液300 L，加入2倍体积的无水乙醇，-20 静置20 min，4 12 000 g离心15 min。7.6 弃上清液，加入1 mL 70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。7.7 加入20 L灭菌一级水溶解沉淀，-20 保存备用。7.8 也可选择市售商品化 DNA提取试剂盒，完成DNA 的提取。7.9 设50 L反应体系，详见附录 B.2。7.10 每次反应设置试验中同时质粒 DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。具体反应程序见附录 B.3。8 结果判 定 8.1 结果判读见表1。表1 结果判 定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM 未检测到或 40 样本核酸浓度低于检测限，报告为阴性 2 FAM 37 报告为阳性 3 FAM 37-40 复检一次，如仍为 37-40，则报告为阴性 8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。8.3 结果参考图谱：见附录 C.1。DB37/T 4032 2020 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂的 配制 A.1 1PBS 溶液(pH 值7.4)磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g。磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g。氯化钠(NaCl)：8 g。氯化钾(KCl)：0.2 g。加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。A.2 蛋白酶K溶液(20 mg/mL)蛋白酶K 100 mg 灭菌一级水 5 mL A.3 10%十 二烷 基硫 酸钠(SDS 溶液，pH7.2)十二烷基硫酸钠 10 g 灭菌一级水 80 mL 浓盐酸 调pH至7.2 灭菌一级水 加至100 mL A.4 70%乙醇 无水乙醇 70 mL 灭菌一级水 30 mL DB37/T 4032 2020 5 B B 附 录 B（规范 性附 录）恒温核 酸扩 增引 物、反应 液体系 与反 应条 件 B.1 恒温核 酸扩 增引 物 见表B.1。表B.1 恒温核 酸扩 增引 物 引物 序列 Asfv-F 5-CTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAC-3 Asfv-R 5-GAGATACAGCTCTTCCAGAYGCATGTTCATC-3 Asfv-Probe 5-AGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTAFCTABAAGATTGATACCATG-3 注：F为FAM荧光基团标记、T为THF、B为BHQ1淬灭基团标记、3末端为C3 Spacer标记。B.2 恒温核 酸扩 增反 应液 体系 见表B.2。表B.2 恒温核 酸扩 增反 应液 体系 组分 用量 L DEPC 水 8.5 A Buffer 29.4 10 M 上游引物 2 10 M 下游引物 2 10 M 探针 0.6 模板 DNA 5 B Buffer 2.5 B.3 恒温核 酸扩 增反 应条 件 见表B.3。表B.3 恒温核 酸扩 增反 应条 件 反应条件 反应温度 39 C 循环数 40 信号采集 每30S 反应时间 20 min DB37/T 4032 2020 6 C C 附 录 C（规范 性附 录）样品检 测结 果图 样品检测结果见图C.1。图C.1 样品检 测结 果图 DB37/T 4032 2020 7 D D 附 录 D（规范 性附 录）英文缩 略表 英文缩略表见表D.1。表D.1 英文缩 略表 英文缩写 英文全称 中文名 ASFV African swine fever virus 非洲猪瘟病毒 RPA Recombinase polymerase amplification 重组酶聚合酶扩增 PBS phosphate buffer saline 磷酸缓冲盐溶液 DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 _