辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法DB12／T 838-2018.pdf

ICS 65.020.20 B 04 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 838 2018 辣椒种子 纯度 SSR 分子标记 鉴定方法 Method of identifying seed purity of pepper by using SSR-based marker 2018-11-07 发布 2018-12-01 实施 天 津 市 市 场 和 质 量 监 督 管 理 委 员 会 发布 DB12/T 838 2018 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由天 津市 农村 工作 委员会 提出 并归 口。本标准 起草 单位：天津 市 农业质 量标 准与 检测 技术 研究所、天津 市蔬 菜研 究 中心、黑 龙江 省农 业科学院农 产品 质量 安全 研究 所。本标准 主要 起草 人：兰 青 阔、吕敬 刚、赵 新、王 成、兰璞、焦 荻、高 素燕、陈 锐、关海 涛、张 耀中、焦贺敏。DB12/T 838 2018 1 辣 椒种子 纯度 SSR 分 子标记 鉴定方 法 1 范围 本标准 规定 了辣 椒种 子纯 度SSR 分子 标记 鉴定 方法 的 原理、仪 器设 备及 试剂、方 法步骤、纯度 计算。本标准 适用 于辣 椒单 交种 的纯度 鉴定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 标准 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 标准。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 标准。GB/T 3543.2 农作 物种 子 检验规 程 扦样 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 种子纯 度 seed purity 种子在SSR 分 子标记 带型 方 面典型 一致的 程度，用具 有本品 种特异 带型 的种子 粒数占 鉴定样 品种 子粒数的 百分 率表 示，以反 映某品 种特 征特 性的 一致 性程度。3.2 聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction(PCR)一种在 体外 通过 酶促 反应 扩增特 异DNA 片 段的 技术。3.3 简单重 复序 列 simple sequence repeat(SSR)由几个 核苷 酸（16 个）为重复 单位 聚集 而成 的长 达几十 个至 几百 个bp（一 般为100 200）的 串 联重复序 列，又称 微卫 星序 列或短 串联 重复 序列，其 高度多 态性 主要 来源 于串 联数目 的不 同。3.4 分子标 记 molecular marker 以蛋白 质、核酸 分子 的多 态性为 基础，鉴 定生 物 在 遗传上 的差 异。4 原理 SSR 分 布于 辣椒 整个 基因 组，每个 位点 上重 复单 位的 数目不 同造 成了 品种 间的 多态性，利 用PCR技术将多态 的SSR 扩 增出 来，通 过电泳 检测 扩增 产物，利 用电泳 图谱 进行 辣椒 种子 纯度鉴 定。5 仪器设 备及 试剂 DB12/T 838 2018 2 5.1 仪器设 备 PCR 仪；测 序电 泳槽；水 平 电泳槽；高 压电 泳仪（3000 V，400 mA，400 W）；万分之 一电 子天 平；微量加 样器；磁力 搅拌器；台式 离心机；紫 外-可 见 成像系 统；胶 片观 察灯；水平摇 床；高 压灭 菌锅；pH计等。5.2 试剂 乙二胺 四乙 酸二 钠（EDTA-Na2）；三 羟甲 基氨 基甲 烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二 烷基 硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢 氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子 甲酰 胺；溴 酚蓝；二甲苯 青FF；甲 叉双丙烯 酰胺；丙烯 酰胺；尿素；亲 和硅 烷；剥 离硅 烷；无水 乙醇；四甲 基乙 二胺（TEMED）；过硫 酸 铵；冰醋酸；硝酸 银；甲 醛溶 液（37%）；Taq DNA 聚 合酶（含Mg2+的10 PCR 缓冲 液）；四种 脱氧 核糖核 苷 酸（dNTPs）；SSR引 物；琼 脂糖；Gold View 染料；定 性PCR试 剂盒；DNA 提取试 剂盒；实验用 水为 重蒸馏水或符 合GB/T 6682 规定 的 一级水 等。除特 殊说 明外，所用 试 剂 均为 分析 纯试 剂。5.3 溶液配 制 相关溶 液配 制方 法见 附录A。6 方法步 骤 6.1 取样 检测样 品的 分样 和保 存，应符合GB/T 3543.2 的规 定，从 中随 机取100 粒 以上 种 子，取其 父母本 材料各10份。6.2 单粒种 子 的DNA 提取 6.2.1 样品预 处理 在玻璃 培养皿 底部 垫上一 层厚度 约3mm 的棉花 或滤 纸，用水 浸湿后 均匀 地撒上 检测样 品，再 于表 面覆盖一 层纱布，置 于光照 培养箱 中。培 养条 件为16h 35 光 照培 养，8h 28 暗培养，待种 子长 出子 叶后备用。6.2.2 DNA 提取 取单株 幼苗子 叶，放入1.5 mL 离心 管中，在液 氮中 研 碎，放 入1.5 mL 离 心管中。将DNA 提取 液预 热到65，每 管放 入400 L混 合 样品，将 离心 管置 于65 金属 浴或 水浴 锅中，保 温30 min 后 取下，向离心管 中加 入400 L 24:1 氯仿-异戊 醇（V:V），振 荡混匀。10 000 g 离心10 min。将上 清液200 L 转入另一 支1.5 mL 离心 管，加入400 L-20 预 冷无 水乙醇 沉淀DNA。10 000 g 离心1 min，弃 上清 液，加入500 L乙醇 乙 酸 铵溶液，6000 g 离心5 min 收集沉 淀。加入100 L TE（pH8.0）溶液 溶解DNA。6.2.3 DNA 的 浓度 和质 量 将DNA 适当稀释 或浓缩，使其OD260 值在0.1 0.8 的区间内，测 定并记录其在260 nm 和280 nm 的 吸光度。以1个OD260 值相当于50 mg/L DNA 浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA 凝胶电泳检测DNA 完整性。DNA溶 液的OD260/OD280 值 应在1.72.0 之 间，或质 量能 复合检 测要 求。6.3 分子标 记筛 选 DB12/T 838 2018 3 用22对 核心 引物 进行PCR 反 应，扩 增双 亲及 送检 样品 各10份DNA，筛 选带 型清 晰，双亲 间差 异大，互补性好 的引 物作 为纯 度鉴 定的SSR 分 子标 记。6.4 PCR 扩增 6.4.1 反应体 系 总体积10 L，包 括5 L 超纯水、1 L 含Mg2+的10 PCR 缓冲 液、0.8 L dNTPs（2.5 mmol/L）、0.6 L SSR 引 物（10 mol/L）、1 L Taq DNA 聚 合酶（2.5 U/L）、1 L DNA（30 50 ng/L），混匀。6.4.2 反应程 序 94 预 变性4 min；94 变性45 s，按 附录B 推荐 的 引物退 火温度 退火45 s，72 延 伸45 s，循环35次；72 延伸10 min；-20 保 存备 用。6.5 变性聚 丙烯 酰氨 凝胶 电泳 按照附 录C 规定 的方 法，进 行4.5%变性 聚丙 烯酰 胺 凝 胶制作 及电 泳检 测扩 增产 物。7 纯度计 算 以筛选 出来 的SSR 分 子标 记 为引物 扩增 送检 样品 的DNA，通过 带型 统计，用 具有 本 品种特 异带 型的 种子粒数 占检 测样 品种 子粒 数的百 分率 表示 纯度，计 算公式 如下：%100%检测样品种子粒数种子粒数 具有本品种特异带型的纯度DB12/T 838 2018 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）溶液配 制 A.1 DNA 提 取液 含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5%SDS，经高 压蒸汽灭菌 后使 用。A.2 引物稀 释 按 照 引 物 合 成 单 的 说 明 先 配 制100 mol/L 的 储 存 液，取 适 量 储 存 液 稀 释40 倍，配 制 浓 度 为2.5 mmol/L 的使 用液。A.3 6 变 性上 样缓 冲液 去离子 甲酰 胺49 mL，0.5 mol/L 的EDTA 溶 液（pH 8.0）1mL，溴 酚蓝0.125 g，二甲苯 青0.125 g。A.4 10 电 泳缓 冲液 Tris 108g，硼 酸55 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液37 mL，定 容至1000 mL。A.5 40%丙 烯胺 胶 丙烯酰 胺190 g，甲 叉双 丙 烯酰胺10 g，定 容至500 mL。A.6 A.6 4.5%丙烯 胺胶 尿素450 g，10 电 泳缓 冲 液100 mL，40%丙烯 酰胺 胶112.5 mL，定容 至1000 mL。A.7 1%亲和 硅烷 20 L 亲和 硅烷，20 L 冰醋酸，加 无水 乙醇 至2 mL。现 用现 配。A.8 2%剥离 硅烷 1 mL 剥 离硅 烷，49 mL 三 氯 甲烷。A.9 10%过 硫酸 铵 0.1 g 过硫 酸铵 溶于1 mL 超 纯水中。现 用现 配。DB12/T 838 2018 5 A.10 固定液 200 mL 冰醋 酸，定容 至2000 mL。A.11 染色液 4 g 硝 酸银，定 容至2000 mL。A.12 显影液 2000 mL 蒸 馏水 中加 入40 g 氢氧化 钠和10 mL 甲 醛。DB12/T 838 2018 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）22 对核 心 引物 22 对核 心引 物见表B.1。表B.1 22 对 核心 引物 表 序号 引物 引物序列（5 3）退火温度 扩增片段大小范围（bp）1 LJ-1 F:AGCCATGGCAGAATTGGAAG R:TTCAGCAGGTTCTGGTTCTGGT 54 97121 2 LJ-2 F:CGCATCTACATCAAGAATCAACCA R:GATGTAGAACAAGGAAGCAGGG 54 150154 3 LJ-3 F:GAUGAATTTTGGAGCCACACAC R:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGA 52 85117 4 LJ-4 F:CAAAACCAAATAGGTCCCCC R:CGCGCAATAATTCAATATCG 60 274342 5 LJ-5 F:TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAG R:GGCAGTCCTGGGACAACTCG 58 81101 6 LJ-6 F:ATGTCGCTCGCAATTTCACT R:CGTAGGGAGGAGCGATAGAG 60 106118 7 LJ-7 F:CGGCCAAATTATTTTTCCCAGT R:TTCCCATAGTTGAAGAUCCTGC 54 136145 8 LJ-8 F:TACGGTTCCTCATCCCAGAAGA R:AGGATGACCAATGTTTTGCCTC 53 138151 9 LJ-9 F:CCCTTCCCTTTTCTCCCTTCTT R:CAGAAACAGCCATTGATGATG 54 142157 10 LJ-10 F:GCGGCCTTTTGATTCATACAAT R:CGTTTTACTGCCCTATCTGCTTG 56 155165 11 LJ-11 F:GCACGAGUCAACAAAAGAGAAT R:CGCTGAUCGAGACAGAGAGAG 53 118121 12 LJ-12 F:TCCCATTTCGCAAGAAAGAAAA R:TCCGATACAGCTGCAGTAGAAAA 54 119135 13 LJ-13 F,TCAGCGATTAAGAATGCGATTG R:CCAAATTGCCCTCTCTCTTCCT 52 116122 14 LJ-14 F:TGTAATTAATTGAGGTGCGCUA R:TCTCTGGTTGACAATTAGGCCC 53 84102 15 LJ-15 F:TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACC R:TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGC 65 142160 16 LJ-16 F:CCACAAAGGGTTTAAGCAGC R:AAGGCAGGAGCAGAGTTCAA 60 126143 17 LJ-17 F:AATGCGGAGGAAGAAGAGGAAG R:TAGTCCTTATCACCGACACGGC 54 7394 18 LJ-18 F:ACGAGGTCCACTTCCCCATTAT R:TTAGAGAAGGAATAACCGGCAGC 55 106124 19 LJ-19 F:CGCGATTCGATTGCTAAATCTC R:CTAATTTCCCAGTTGCGTCTGC 56 237255 20 LJ-20 F:TTCGGCTATTTGAACAGAAGCA R:TGATCCCTTCTTGTTTGATTTTTG 54 140168 21 LJ-21 F:TTTTGGGGTTCAATAAAGCTGTG R:TTCAACAAGATCATCAATTCACCA 54 150150 22 LJ-22 F:CCAAACGAACCGATGAACACTC R:GACAATGTTGAAAAAGGTGGAAGAC 58 289318 DB12/T 838 2018 7 C C 附 录 C（规范 性附 录）制胶过 程 C.1 凝胶制 作 将玻璃 板洗 净，用无 水乙 醇擦两 遍，晾干。在 长板 上涂1%亲和 硅烷，在 短板 上涂2%玻璃 硅烷。操 作过程中 防止 两块 玻璃 板互 相污染。待 玻璃 板彻 底干 燥后，将其 组装 好，用水 平仪调 平。取4.5%丙烯酰胺胶80 mL，加 入TEMED 80 L和10%过硫 酸铵400 L，迅速 混匀后 灌胶。灌胶 过程中 防止气 泡产 生。灌胶结束 后，将梳 子齿 向外，轻轻 的插 入胶 中，使其 聚合1 h 以 上。C.2 预电泳 待胶凝 固后，拔 出梳 子，将电泳 槽组 装好，80 W 恒 功率下 预电 泳15 min 20 min。C.3 变性 在20 L PCR 产物 中加入4 L 6 变性 上样 缓冲液，混匀 后，在PCR仪 上运 行 变性程 序：95 变性5 min，4 冷却10 min。C.4 电泳 用洗耳 球吹洗 加样 槽，清 除气泡 和杂质。每 个加样 孔加入5 L 变性后 的PCR 产物。80W 恒 功率 电 泳至上部 的指 示带（二 甲苯 青）到 达胶 板的 中部。C.5 银染 电泳结 束后，小心 分开两 块玻璃 板，凝 胶紧 贴在长 板上。将长板 置于 固定液 中轻轻 晃动3 min；双蒸水快 速漂洗1次，不超 过10 s；染色液 中染 色5 min；双蒸 水快速 漂洗1 次，不 超过10 s；显 影液 中轻轻晃动 直至 带纹 清晰；固 定液中 定影5 min；双蒸 水 漂洗1 min。_