蜜蜂黑蜂王台病诊断技术DB35／T 1761-2018.pdf

ICS 65.140 B 47 DB35 福建省地方标准 DB35/T 17612018 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术 Diagnostic techniques for Black Queen Cell Disease of Honey Bees 2018-04-03发布 2018-07-03实施福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 17612018 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 疾病概述.2 6 临床诊断.2 7 实验室诊断.2 8 综合判定.5 附录 A（规范性附录）溶液的配制.7 附录 B（资料性附录）溶液的配制.8 附录 C（资料性附录）核酸扩增电泳图.9 DB35/T 17612018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、福建农林大学、吉林出入境检验检疫局、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。本标准主要起草人：张体银、郑腾、王武军、黄少康、宋战昀、张永东、张志灯、白泉阳、林杰、于师宇。DB35/T 17612018 1 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术 1 范围 本标准规定了蜜蜂黑蜂王台病临床诊断、实验室诊断和综合判定。本标准适用于蜜蜂黑蜂王台病的诊断和蜜蜂黑蜂王台病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 王台 queen cell 候选蜂王的寝宫，即工蜂为培育蜂王所筑成的巢房。注：王台亦名“母蜂房”。3.2 黑蜂王台病 black queen cell disease 由蜜蜂黑蜂王台病毒（Black queen cell virus）引起的蜂王幼虫及蛹感染，并可导致巢房变黑，进而引发蜜蜂大量死亡的一种严重的蜜蜂病毒病。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。BQCV：黑蜂王台病毒（Black queen cell virus）Ct：循环阈值（Cycle threshold）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate）dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside triphosphate）EB：溴化乙锭（Ethidium bromide）RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction）TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl aminomethane-boric acid-ethylene diamine tetraacetic acid）DB35/T 17612018 2 5 疾病概述 蜜蜂黑蜂王台病（Black queen cell disease）是由黑蜂王台病毒(Black queen cell virus，BQCV)引起的一种常见的蜜蜂病毒病，春季和初夏高发，主要危害蜂王的幼虫和蛹，并可导致巢房变黑，进而引发蜜蜂大量死亡，目前已呈全球性分布。6 临床诊断 6.1 临床症状 6.1.1 患病蜂王幼虫体色变黄，表皮逐渐硬化呈囊状。6.1.2 患病蜂蛹体色变暗，快速死亡。6.1.3 患病蜂王体色先变为灰白色，逐渐再变为黑色，最后王台内壁变成棕色或黑色。6.1.4 成年蜜蜂主要有尾部变黑，体毛脱落、斑纹混乱、蜜蜂吻拉长，严重时无法飞行而只能爬行移动。6.2 初步诊断 当蜂群出现以上部分或全部临床症状时，可做出初步诊断，确认需要进行实验室诊断。7 实验室诊断 7.1 设备、材料和试剂 7.1.1 设备 7.1.1.1 普通 PCR 扩增仪。7.1.1.2 荧光 PCR 仪。7.1.1.3 台式冷冻高速离心机。7.1.1.4 微量移液器（0.5 L10 L,2 L20 L,20 L200 L,100 L1000 L）。7.1.1.5 水平电泳仪。7.1.1.6 凝胶成像系统。7.1.1.7 电子天平（感量 0.01 g）。7.1.1.8 冰箱（2 8 和80）。7.1.2 材料和试剂 7.1.2.1 试验用水应符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格要求。7.1.2.2 焦炭酸二乙酯处理水（DEPC 水）。7.1.2.3 Trizol。7.1.2.4 三氯甲烷。7.1.2.5 异丙醇。7.1.2.6 无水乙醇。7.1.2.7 10One Step RNA PCR Buffer。7.1.2.8 MgCl2。7.1.2.9 dNTPs（含dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。DB35/T 17612018 3 7.1.2.10 逆转录酶。7.1.2.11 Taq DNA 聚合酶。7.1.2.12 琼脂糖。7.1.2.13 分子量标准（100 bp 1000 bp）。7.1.2.14 TBE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A中的 A.1。7.1.2.15 EB（10 mg/mL），配制方法见附录 A中的 A.2.7.1.2.16 上样缓冲液，配制方法见附录 A 中的 A.3。7.1.2.17 DNA 纯化回收试剂盒。7.1.3 引物和探针序列 7.1.3.1 普通 RT-PCR引物序列 F1 5-TGG TCA GCT CCC ACT ACC TTA AAC-3；R1 5-GCA ACA AGA AGA AAC GTA AAC CAC-3；扩增片段约701 bp，用ddH2O溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。7.1.3.2 荧光 RT-PCR引物和探针序列 上游引物 F2 5-TCA CCC CTA ACA ACA ACT ATT CCC-3；下游引物 R2 5-GCT CCC GTC TTA GAG TAA TCC TTC-3；探针P序列为 FAMCGACAGCGTGCCAAAGAGAGTAAGGG TAMRA；扩增片段约188 bp，用ddH2O 溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。7.1.4 质控物质 7.1.4.1 阳性对照为含 BQCV 的阳性组织或含目的片段的 RNA；7.1.4.2 阴性对照为未感染 BQCV的健康蜜蜂组织；7.1.4.3 空白对照用水代替样品。7.2 样品采集 据临床诊断结果，选择疑似感染的蜂群，无菌割取一块大小约3 mm3 mm的带有病、死虫或蛹蜂的王台；也可无菌挑取单个病、死虫或蛹23只装入无菌的小试管内；发现患病蜂王也可采取单个蜂王个体；对于成蜂样品，也可挑取蜂群内王台上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂1020只。样品保存于2 8 的条件下，24 h内送实验室检测。7.3 BQCV的RT-PCR检测 7.3.1 RNA提取 选取不超过300 mg待鉴定虫体、蜂体或王台，置于DEPC处理过的研钵中，加入液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase并经过液氮冷却的1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol试剂，用移液器充分吹打1020次，室温放置5 min；加入200 L三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温放置15 min；12 000 r/min离心15 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 放置20 min；12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀用1 mL 75乙醇清洗；10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀室温干燥5 min；加20 L DEPC水溶解RNA沉淀。-80冰箱保存备用，RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。RNA提取也可采用其他等效的提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒，代替以上方法。DB35/T 17612018 4 7.3.2 RT-PCR反应 7.3.2.1 反应体系 在0.2 mL PCR反应管中，按表1配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表1 BQCV RT-PCR 反应体系(25 L)组分 加样量(L)终浓度 10One Step RNA PCR Buffer 2.5 1 MgCl2（25 mmol/L）2.5 2.5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each）0.5 0.2 mmol/L RNase Inhibitor（40 U/L）0.5 0.8 U/L 逆转录酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L 引物F1（10 mol/L）1.0 0.4 mol/L 引物R1（10 mol/L）1.0 0.4 mol/L DEPC水 13/模板/对照 3/7.3.2.2 反应程序 将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定：60 反转录30 min；95 预变性2 min；之后95 30 s，55 30 s，72 45 s，运行35个循环；72 补充延伸10 min，4 保温。以水作为空白对照，同时设阳性对照和阴性对照。7.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液(配制方法见附录A中的A.1)配制1.5%的琼脂糖凝胶平板，其中含有1 g/mL EB（配制方法见附录A中的A.2)（或等效商品化核酸染料代替EB）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 L PCR产物和2 L上样缓冲液(配制方法见附录A的A.3)混匀后加入样品孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。5 V/cm电泳约0.5 h，当溴酚蓝到达底部时停止。7.3.4 测序 使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约701 bp的DNA片段，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，参考序列参见附录B中的B.1，同源性要达到95%以上方可判为阳性。7.3.5 结果判定 经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条约701 bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸条带，参见附录C中的图C.1。待检样品经核酸扩增电泳后，在相应约701 bp DNA位置上有条带并经测序验证者为阳性，无条带或条带的大小不是约701 bp的为阴性。DB35/T 17612018 5 7.4 BQCV的实时荧光 RT-PCR检测 7.4.1 实时荧光 RT-PCR反应 7.4.1.1 反应体系 在0.2 mL PCR反应管中，按表2配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表2 BQCV实时荧光 RT-PCR反应体系(25 L)组分 加样量(L)终浓度 10One Step RNA PCR Buffer 2.5 1 MgCl2（25 mmol/L）2.5 2.5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each）0.5 0.2 mmol/L RNase Inhibitor（40 U/L）0.5 0.8 U/L 逆转录酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L 引物F2（10 mol/L）0.5 0.2 mol/L 引物R2（10 mol/L）0.5 0.2 mol/L 探针P（10 mol/L）0.5 0.2 mol/L DEPC水 14/模板/对照 2.5/7.4.1.2 反应程序 将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定：60 反转录30 min；95 预变性2 min；之后95 变性15 s，60 退火30 s，收集荧光，共40个循环。同时设阳性、阴性对照和空白对照。7.4.2 结果判断 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值40或未检出，二者均成立才可判定试验成立。检验样本Ct值35时，报告BQCV阳性；检验样本35Ct值40时，重复一次，如果Ct值仍然40，并且曲线有明显的对数增长期，报告BQCV阳性，否则报告BQCV阴性；样本Ct值为零或Ct值40时，报告未检出BQCV。8 综合判定 8.1 经 RT-PCR 和/或实时荧光RT-PCR 检测为阳性，若出现临床症状，可判定患有蜜蜂黑蜂王台病；若无临床症状，判定为 BQCV 携带者。DB35/T 17612018 6 8.2 仅有临床症状，但 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测为阴性则不能称患有蜜蜂黑蜂王台病，需进一步做其他病检查。DB35/T 17612018 7 附 录 A（规范性附录）溶液的配制 A.1 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g 加水到 1 000 mL 用 5 mol/L的盐酸(HCl)调到pH 8.0。A.2 EB(核酸染色剂)溴化乙锭（EB）100 mg 蒸馏水 10 mL 用蒸馏水配制成10 mg/mL的浓缩液。用时每100 mL染色液中加10 L的浓缩液。A.3 上样缓冲液 溴酚蓝 0.25 g 蔗糖 40 g 蒸馏水 100 mL 溶解混匀后121 高压灭菌15 min。DB35/T 17612018 8 附 录 B（资料性附录）溶液的配制 B.1 RT-PCR扩增的BQCV基因序列（共 701 bp）tggtcagctcccactaccttaaacatagtggcggagatgtatgcgctttatcgaggaggagttcgagttaaagttgttactgagaagggtgtggatttcgtcagagctaccgttagtcctcaacagacttatggcagtgatgtcgctcctactactcatatcagtactcctttggcaatagaacaaatacctataaagggagtcgcagagttccaaataccgtactatgctccatgtttgtcatcttcgtttagagcgaattcggaaacattttactatagttcaggtcggaataatctcgatatagccacttcacctccttccatcaatcgctattatgcggtaggtgcgggagatgatatggacttttccatctttatcggtacgccgccctgcattcacgcatctcagacggcccagtttaccaaaataaaacaaggtaaagtgtatgatttgaggtatgatcagtatgacccttttagggaagtccaggacggtacggcgttcctcaatgctcgtagtgttgaggatagcgatttgttgtgagctcctttagagggagggctcactttatctattgcttaaatcggtaagccacaaacttttctaagtgtcatgagtttcttctcggttcttctcatgattactaatcgaaccgtgtgtagagtcagaatgttgtggtttacgtttcttcttgttgc B.2 实时荧光RT-PCR扩增的BQCV基因序列（共 188 bp）tcacccctaacaacaactattcccgtagatttcatagtatacggtcattttgaggacgtggagttgggttgcccaacttctgggatgttggctcagtccggtctgaaggtgcaacctcctacgaactctgactctcgacagcgtgccaaagagagtaagggcaagaaggattactctaagacgggagc DB35/T 17612018 9 附 录 C（资料性附录）核酸扩增电泳图 核酸扩增电泳图见图C.1。说明：M100 bp DNA Ladder；1BQCV阳性样品；2BQCV阳性对照；3阴性对照；4空白对照。图C.1 核酸扩增电泳图 _ 1000 bp 700 bp 500 bp M 1 2 3 4 DB35/T 17612018 福建省地方标准 蜜蜂黑蜂王台病诊断技术 DB35/T 17612018*2018年 4月第一版 2018年 4月第一次印刷