霍山石斛分子鉴定技术规程DB34／T 3244-2018.pdf

ICS 65.020 B 39 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 32442018 霍山石斛分子鉴定技术规程 The technical specifications for molecular indentification of Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng 文稿版次选择 2018-12-29发布 2019-01-29实施安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 32442018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由皖西学院提出。本标准由安徽省林业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：皖西学院、霍山县石斛（灵芝）产业发展办公室。本标准主要起草人：赵群、陈乃富、陈存武、韩邦兴、孙传伯、戴军、宋向文、陈乃东、姚厚军、李世海。DB34/T 32442018 1 霍山石斛分子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng）分子鉴定的术语与定义、分子鉴定技术、资料记录和档案管理。本标准适用于霍山石斛与河南石斛、细茎石斛、铁皮石斛、金钗石斛之间的定性分子鉴定。鉴定材料包括以上各种石斛的根、茎、叶、花、果实以及干条、枫斗、切片和含有霍山石斛成分的粉末。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB34/T 486 霍山石斛 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 特异性引物 specific primer 能特异性扩增霍山石斛 ITS 或 trnL-trnF DNA 片段的位点特异性鉴别引物。3.2 标准物种的特异性扩增片段 the specific sequence of standard species 用特异引物 CP2s 和 CP2a 扩增出的霍山石斛 DNA 片段。3.3 标准物种扩增片段的特异性位点 the specific site of the sequence of standard species 用特异性引物 HuoS 和 HuoA 扩增的片段中在 5 3 方向第 56 位的碱基 G。4 分子鉴定技术 4.1 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A。4.2 溶液配制 DB34/T 32442018 2 溶液配制方法见附录B。4.3 引物 通用引物 TY2s：5-CGCCATATTGATTGACACG-3 通用引物 TY2a：5-GGCAGCCAACGAGAAGA-3 特异性引物 CP2s：5-TTCGTGGGATGGGGTTC-3 特异性引物 CP2a：5-TGCACATCCGAGCCTGA-3 特异性引物 HuoS：5-AAAAGGGATAGGTGC-3 特异性引物 HuoA：5-GATTTGGGTTGTGATT-3 4.4 操作程序 4.4.1 DNA提取 4.4.1.1 取干燥样品 50 mg 或新鲜样品 100 mg。用 CTAB 法提取总 DNA。具体过程详见附录 C。4.4.1.2 所获 DNA 质量能够符合 PCR 扩增需要的 DNA 提取方法都适用于本标准。4.4.1.3 样品应符合 DB34/T 486 的规定。4.4.2 PCR扩增 4.4.2.1 反应体系 反应体系总体积为 25 L，反应组分配制如下。DNA 模板 0.5 L（5-50 ng），上游引物 1 L（10 pmol），下游引物 1 L（10 pmol），10PCR Buffer 2.5 L，MgCl2（25 mM）1.5 L，dNTPs（10 mM）0.5 L，Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.5 L，ddH2O 补足至 25 L。4.4.2.2 反应程序 反应程序可根据引物不同选下列程序中的一种。程序 1：95 5 min、35个循环（每个循环包括 95 30 s，55 30 s，72 30 s）、72 10 min。所用引物为通用引物 TY2s和 TY2s。程序 2：95 5 min、45个循环（每个循环包括 95 30 s，60 30 s，72 30 s）、72 10 min。所用引物为特异性引物 CP2s 和CP2a。程序 3：95 5 min、35个循环（每个循环包括 95 30 s，46 30 s，72 30 s）、72 10 min。所用引物为特异性引物 HuoS 和HuoA。4.4.3 模板 DNA质量验证 反应程序1 结束后，分别取 5 L 扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪中观察并拍照。实验中设置无模板 DNA 的空白对照、阴性对照和阳性对照。实验重复 3 次。4.4.4 PCR产物检测 反应程序2 结束后，分别取 5 L 扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪中观察并拍照。实验中设置无模板 DNA 的空白对照、阴性对照和阳性对照。实验重复 3 次。DB34/T 32442018 3 4.4.5 测序鉴定 对反应程序3 的扩增产物进行测序，每个样本重复测序 3 次。4.5 数据采集 4.5.1 模板 DNA质量验证 能扩增出 DNA 条带的数据记录为 1；不能扩增出 DNA 条带的数据记录为 0。4.5.2 PCR产物检测 能扩增出 DNA 条带的数据记录为 1；不能扩增出 DNA 条带的数据记录为 0。4.5.3 测序鉴定 特异性引物 HuoS 和 HuoA 的 PCR 产物经测序后，长度为 171bp，并在其 53方向第 56 位为 G（和标准物种的特异性序列相同）的数据记录为 1；第 56 位不为 G 的数据记录为 0。4.6 判定标准 4.6.1 模板 DNA质量验证 如果数据记录为 1，判定为该样品的 DNA 质量合格，能用于后续实验；如果数据记录为 0，判定为该样品的 DNA 质量不合格，不能用于后续实验。4.6.2 PCR产物检测 如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛或细茎石斛，需要对样品进行测序检测；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含有霍山石斛。4.6.3 测序鉴定 如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含霍山石斛。5 资料记录和档案管理 5.1 资料记录 霍山石斛分子鉴定中的 DNA 质量检测数据、PCR 产物检测数据和测序检测数据等均应作详细的记录。5.2 档案管理 所有霍山石斛分子鉴定资料均须建立档案并由专人保管，长期保存。DB34/T 32442018 4 A A 附 录 A（规范性附录）仪器设备及试剂 A.1 仪器设备 A.1.1 PCR 扩增仪。A.1.2 电泳仪。A.1.3 电子天平。A.1.4 微量移液器。A.1.5 微波炉。A.1.6 高压灭菌锅。A.1.7 pH 酸度计。A.1.8 台式高速离心机。A.1.9 制冰机。A.1.10 凝胶成像系统或紫外透射仪。A.1.11 水浴锅或金属浴。A.1.12 冰箱。A.1.13 紫外分光光度计。A.2 试剂 A.2.1 乙二胺四乙酸二钠。A.2.2 Tris 碱。A.2.3 浓盐酸。A.2.4 氢氧化钠。A.2.5 Taq DNA 聚合酶 Buffer:含Mg2+。A.2.6 四种脱氧核苷酸（dNTPs）。A.2.7 Taq DNA 聚合酶。A.2.8 特异性引物。A.2.9 通用引物。A.2.10 溴酚蓝。A.2.11 二甲苯氰（FF）A.2.12 甘油。A.2.13 硼酸。A.2.14 无水乙醇。A.2.15 冰醋酸。A.2.16 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。A.2.17 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。A.2.18 氯仿。A.2.19 异戊醇。DB34/T 32442018 5 A.2.20 异丙醇。A.2.21 RNA 酶。A.2.22 琼脂糖。A.2.23 液氮。A.2.24 DNA 分子标准-600(DNA Marker)。DB34/T 32442018 6 B B 附 录 B（规范性附录）溶液配制 B.1 DNA 提取溶液的配制 B.1.1 0.5 mol/L EDTA 溶液 称取 186.1 g Na2EDTA2H2O 溶于 800 mL 水中，用固体 NaOH 调 pH 至 8.0，定容至 1000 mL，高压灭菌。B.1.2 1 mol/L Tris-HCl 溶液 称取 60.55 g Tris 碱溶于适量水中，加 HCl 调 pH 至 8.0，定容至 500 mL，高压灭菌。B.1.3 0.5 mol/L HCl溶液 量取 25 mL 浓盐酸，加水定容至 500 mL。B.1.4 2 CTAB 分别称取 CTAB 20 g，NaCl 81.816 g，PVP 20 g，分别量取 1 mol/L Tris-HCl溶液（pH8.0）100 mL，0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）40 mL，定容至 1000 mL。B.1.5 5 mol/L NaCl溶于水中，加水定容至 500 mL。B.1.6 氯仿异戊醇（24:1）分别量取 240 mL 氯仿和 10 mL 异戊醇，将两者混匀。B.2 PCR 扩增溶液的配制 B.2.1 特异性引物和通用引物 用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均为 10 mol/L 的储存液，各量取 10 L 混合。注：干粉配制前应首先快速离心。B.2.2 6凝胶加样缓冲液 分别称取 25 mg 溴酚蓝和 25 mg 二甲苯氰 FF，置于 15 ml 塑料离心管中；向离心管中加 6 ml去离子水，充分搅拌溶解；加入 3 ml 甘油混匀，最终用去离子水定容至 10 ml，4保存。B.3 琼脂糖凝胶电泳溶液的配制 B.3.1 10TBE缓冲液 分别称取 Tris 碱 108 g，硼酸 55 g，量取 0.5 mol/L EDTA 溶液 37 mL，定容至 1000 mL。DB34/T 32442018 7 B.3.2 1TBE 缓冲液 量取 10TBE 缓冲液 500 mL，加水定容至 5000 mL。B.3.3 10 mg/mL 溴化乙锭溶液 称取 1 g 溴化乙锭溶于适量水中，定容至 100 mL。B.4 琼脂糖凝胶的制备 称取适量琼脂糖粉，加入适量 1TBE 缓冲液，在沸水浴中将琼脂糖悬浮物加热至琼脂糖完全溶解，配制成浓度为 1或 2的琼脂糖凝胶。DB34/T 32442018 8 C C 附 录 C（资料性附录）CTAB法提取总 DNA 将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过 40 目筛。将粉末转移到 2.0 mL 的微量离心管中，加入 900 L 已灭菌的 CTAB 提取液（配方：2(2 g/100ml)CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl）、0.02 g PVP 40000、10 L-巯基乙醇充分振荡混匀，65水浴 1.5 h2 h，期间轻摇 23 次。结束后取出冷却至室温，加入 900 L 氯仿-异戊醇（体积比 24：1），充分振荡混匀，12000 g 离心 10 min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（体积比 24：1），充分振荡混匀，12000 g 离心 10 min。取上清，加入 2/3 体积预冷的异丙醇溶液，-20放置 0.5 h 以上。取出，12000 g 离心 10 min，弃上清，沉淀用 70（体积分数）乙醇洗涤两次，37挥干乙醇，加入 1 L RNAase 和 100 L ddH2O 溶解。用 1琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的浓度和纯度。稀释成工作液或-20保存备用。注：以上为推荐的 DNA 提取方法。所获 DNA 质量能够符合 PCR 扩增需要的 DNA 提取方法都适用于本标准。_