鲫疱疹病毒II型病诊断技术规程DB51／T 2467-2018.pdf

1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24672018 鲫疱疹病毒II型病诊断技术规程 2018-04-18发布 2018-05-01实施四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24672018 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂和材料.2 5 设备和器械.2 6 临床检查.2 7 实验室样品采集.2 8 病毒的分离.2 9 病毒鉴定.3 10 综合判定.4 附录 A（规范性附录）试 剂 配 方.5 附录 B（资料性附录）CyHV-2 解旋酶基因参考序列（1446bp）.6 DB51/T 24672018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川农业大学。本标准起草人：耿毅、余泽辉、陈德芳、邓梦玲、黄小丽、欧阳萍、郑李平。DB51/T 24672018 1 鲫疱疹病毒 II型病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鲫疱疹病毒II型病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病毒分离、病毒鉴定和综合判定等技术规程。本标准适用于鲫（Carassius auratus）与金鱼疱疹病毒II型病的诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。3.1 鲫疱疹病毒 II型 Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2 是一种感染鲫鱼及其变种（金鱼、异育银鲫与彩鲫等）的高致病性病毒，又称金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV）或疱疹病毒性造血器官坏死病病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV）。3.2 巢氏 PCR Nested Polymerase Chain Reaction 巢氏聚合酶链氏反应。3.3 CPE Cytopathic effect 细胞病变效应。3.4 GFF Goldenfish fin 金鱼鳍细胞系。DB51/T 24672018 2 4 试剂和材料 4.1 水 用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。4.2 试剂与培养基 按 GB/T 4789.28 与 SC/T 7014 规定执行，金鱼鳍细胞系（GFF）、小牛血清（FBS）、M199营养液、青霉素、链霉素。Taq酶、dNTPs、Mix-reaction buffer、DNA分子量标准参照物（1000bp DNA Maker）与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。4.3 巢氏 PCR 引物 DNA解旋酶基因巢氏PCR扩增引物外，P1-F：5-TGAAATGTCAAAAGTGGATGG-3，P1-R：5-TATTCCCAGACAGCCTTCAAA-3，扩增片段大小716bp；内引物，P2-F：5-GAACACCGCTGCTCATCATC-3，P2-R：5-ACTCTTCGCAAGTCCTCACC-3，扩增片段大小357bp。-20保存。5 设备和器械 主要设备与器械如下：解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、超净工作台、一次性滤器（0.22 m）、普通冰箱、超低温冰箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、水平电泳系统、凝胶成像系统与CO2培养箱等。6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼离群独游，摄食减少或停止摄食，常在池塘边呈浮头状缓慢游动。6.2 外部检查 病鱼体表出血，尤其以口、鳃盖、眼球周围、下颌、鳍条基部最为明显；部分病鱼腹部膨大，眼球突出。6.3 剖检 鳃明显充血、出血，呈现典型“大红鳃”，或腐烂坏死；肝、肾肿大、出血；脾肿大，发黑。部分病鱼鳃丝苍白，鳔壁瘀斑状出血。7 实验室样品采集 样品采集按 GB/T 18088 与 SC/T 7103 执行。8 病毒的分离 DB51/T 24672018 3 8.1 样品处理 应在10C以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，再用细胞培养液PBS缓冲液(A.1)按1:10的最终稀释度组织悬液，加入100IU/mL双抗（青霉素、链霉素A.2）后，置4C冰箱作用1-2h后，反复冻融3次，用0.22 m的一次性滤器过滤除菌，滤液保存于20或以下温度冷冻保存。8.2 细胞接种与观察 将上述滤液用细胞培养液(A.3)再做两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100、1:1000三种稀释度的滤液，分别接种到生长24-48h的GFF单层细胞，按每2cm2的细胞单层接种100 L，的中，25C吸附1-2h后弃病毒液，然后加含2%FBS和100IU/ml双抗的M199细胞培养维持营养液(A.4)，置于25C培养。接种滤液后的细胞，7d内每天每天用倒置显微镜观察CPE出现情况。典型的CPE为细胞空泡、变圆、脱落。若细胞出现CPE，收集细胞液进行鉴定。若细胞在接毒后7d未出现CPE，盲传一次，再培养观察7d，未出现CPE的样品则可判定为阴性。9 病毒鉴定 9.1 样品处理 对有临床症状的病鱼，按8.1的要求取样匀浆后取50mg-100mg于1.5ml EP管中；对出现CPE的细胞培养样品取450 L于1.5ml EP管中。用CyHV-2核酸作为阳性对照，无感染CyHV-2鲫鱼正常组织或无病毒感染的细胞培养物为阴性对照，用等体积的双蒸水作为空白对照。9.2 DNA 提取 DNA提取可使用商品化的组织病毒DNA抽提试剂盒(按说明书操作)，或使用传统酚-氯仿提取法，具体操作如下（传统法）：a)将样品置于-40冰箱反复冻融 3 次，12000r5min。b)取上清 400 l，加入 500ul tris-饱和酚，充分混合，静置 5min，12000r5min，4。c)取上清加入饱和酚，氯仿各 200 l，混匀，静置 5min，12000r5min，4。重复一次。d)取上清加入 200 l 氯仿，混匀，12000r5min，4，此时将出现分层。如果中层蛋白多，则重复上一步骤。e)取上清加 1-2 倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20min，12000r5min，4。f)弃上清，用 75%酒精洗涤，12000r5min，4，重复操作一次。g)弃上清，操作台中自然晾干后，20-30 lTE 溶解沉淀，-20保存，备用。9.3 巢氏 PCR扩增反应 分两步进行，先使用外引物P1-F和P1-R进行PCR扩增，将获得的PCR产物为模板使用内引物P2-F和P2-R进行二次扩增。9.3.1 第一次 PCR扩增反应 反应体系：12.5 L Mix-reaction buffer，P1-F和P1-R各 1 L（10 mol/L），DNA模板2 L，无菌双蒸水补足体积至25 L。混匀后，3000r/min离心30s。反应条件：94C预变性5min，94C变性30s，55C 退火30s，72C 延伸40s，循环30次，最后在72C延伸10min。DB51/T 24672018 4 9.3.2 第二次 PCR扩增反应 反应体系：12.5 L Mix-reaction buffer，P2-F和P2-R引物各 1 L（10umol/L），取1 L第一次PCR产物为模板，无菌双蒸水补足体积至25 L。混匀后，3000r/min离心30s。反应条件：同第一次PCR反应。9.4 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A.5）配制1的琼脂糖（A.6）平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液（A.7）刚好淹没胶面。将上述6 L样品和2 L溴酚蓝指示剂溶液（A.8）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20 min-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察。9.5 结果判定 第一次PCR后阳性对照出现一条716bp的DNA片段条带，阴性对照和空白对照没有该扩增条带。第二次PCR后阳性对照出现一条357bp的DNA片段条带，阴性对照和空白对照没有该扩增条带。待测样品PCR扩增后能在相应的716bpDNA位置上有带，且巢氏PCR扩增后在相应357bp位置上有带者；或者虽经PCR扩增后可能因为浓度太低看不到可见的目的条带，但第二次PCR扩增后在相应357bp位置上有带者，均可判定为阳性，无带则为阴性。若第二次PCR扩增条带大小和阳性片段接近难以确定，则进行测序，并与已知序列（附录B）比对，同源性达98%以上则为阳性，否则为阴性。10 综合判定 有临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为CyHV-2阳性，判定患鲫疱疹病毒II型病。细胞培养出现典型CPE，巢氏PCR检测阳性；直接提取病灶组织 DNA 作为模板，巢氏 PCR检测阳性。若没有临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为 CyHV-2 阳性，判定为 CyHV-2 携带。细胞培养出现典型 CPE，巢氏 PCR 检测阳性；直接提取组织 DNA 作为模板，巢氏 PCR 检测阳性。DB51/T 24672018 5 A A 附 录 A（规范性附录）试 剂 配 方 A.1 PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)800 mL超纯水中溶解 8gNaCl，0.2g KCl，3.58g Na2HPO412H2O，0.24g KH2P04，用1mol/L HCl调节pH为7.4，加超纯水定容至1L，高压灭菌，室温保存备用。A.2 双抗 将青霉素和链霉素霉素用超纯水配成各为10,000IU/mL浓度的混合储存液，经0.22 m孔径的滤膜过滤后分装，-20C保存，使用时的工作浓度为100 IU/mL。A.3 M199营养液 按说明书方法进行配制，按说明书加入一定量的NaHCO3调节营养液 pH值为7.2，定容至1L，0.22 m滤器过滤除菌后分装，4C保存备用。A.4 细胞生长液（含 10%胎牛血清的M199）、细胞维持液（含 2%胎牛血清的M199）相应加入胎牛血清即可。A.5 TE缓冲液（pH8.0）将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。A.6 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖1g中加入1xTAE缓冲液100mL，加热溶解后，加入5 L Goldenview混匀。A.7 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和50mL 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至500mL，室温保存。使用时，配成1TAE电泳缓冲液。A.8 溴酚蓝指示剂溶液 6上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。DB51/T 24672018 6 B B 附 录 B（资料性附录）CyHV-2 解旋酶基因参考序列（1446bp）1 ATGTGCAACG TGACGGCGAG TACTCTGAAC GCTGCCGGTA TACACGCTGA CTCGAGGACC 61 ATACACAGCT ACATGGGTTT CAACACGACC GAGCTGTTGG ATCTGAACGC TTCGGACGAG 121 ACGTGGTTCC TAGCCTACAA GGAGAGACAC AAGGAGTCCC TGAATAATCT ACAAAAGTCT 181 CACAGGGCTT ACATCGCCAA CCCAACGCAC GAGTGCGAGT CTCTCAGGAT GAGATGCATG 241 AAATGTCAAA AGTGGATGGA CGATCCACAG CTACCCAATA ACGCCGCTCC CATACAGACC 301 AACGTGTTTT CGGGTCCCGC AAGAACACCG CTGCTCATCA TCGACGAGTA CGGGATGCTC 361 ACGGGTCCCA TGCTGGCCAG GGTTCTGATC GCGCTCAAGC TGTGGGCACC TCCGGGGGAT 421 CAACACCTGG TGGCGATAGT GGGTTCGGTC ACTCAGCTAC AGCCGGGCAG GGGACCCGAG 481 GACAGGGACA GGCCCGACGA CGGTCTGTGG ACGTTTTCGA AATGGGATCA GGTCAAGTGC 541 GCCTCTTTCA ACCTACCCTT TAGCGTCAGG TCCATAGAGG ATCCAGAGTA CAGCGAGTGT 601 CTGGATATGG TTCAGCACAA CGTTAGCACC GTACGTTTCC AAGAGATTAT GCAGTCTCGG 661 GTGAGGACTT GCGAAGAGTT TGATTTCTAC ACGCCTCGCA TCATGCATCA NGACAACGCG 721 GTCAGACAAC TCAACGAGTC TTGTATGAAA AAGACTGTGG GCGCCGAACG GATCTTCAAG 781 CCCAAGATCA ATCACAATAA CGTGCAGAAC CCGGACGAGC GTAGAAAGTT TGCAGCCGTG 841 GTCCGTCAAC GGTTCAAGCA CATTGACTTC TTTCAAGGCG TCCGAATCAA GGTCGGATCT 901 CTGGTGTGCG TACTAAAATA TCAAACTCAA GTGTTTGAAG GCTGTCTGGG AATAGTGGAA 961 TCAGTACAAC CCGTCATGGT ACGCCTTTTT TTGTTTGTTT GTTTGTTTGA TGAGACGATG 1021 GTGACTATGG TTAATGTGTT GTGTTGTGTT TGTGTACAGG TACGATCTCT GGAATCTCAG 1081 AAGGTTCACT CCATAGGACC TTCCACATTC AACTTTGACA AGATGAGGAC CGTGGAGTTT 1141 ATGCCTCTGA AACTGGCGCA CGGCATGAAT ACTTATTTCT GCCAGGGACT GACGTTCAAG 1201 TTTCCAGTGG TTTACTGTCC ACCAAATTTT TACGCGTCCA GTCCCATCAA ACCGAGTTGT 1261 TATGTTGTGT GTACAAGGGT GACAAATCGG GGTTTACTAA ACTTGACCAA CTGTTCTTTC 1321 GCCAACACTA TAACCGGACA GACTTACTAC TTTTCACCCG AGTGTGTTCG GTTCAAGTTG 1381 GATTTCGAGC TGGGCTACCG ACTGGATCCA GCGTTCAGAA TTCAGAAAAA CCCTAAAAGA 1441 CGGTAG _ DB51/T 24672018