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ICS 65.020.01 CCS B 16 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3378 2021 辽宁省松 材线虫病 检验鉴定 技术规程 Technical regulation on quarantine for the pine wilt disease in Liaoning province 2021-01-30 发布 2021-03-02 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/T 3378 2021 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.2 5.2 7.3 8.3 A.5 B.6 C.8 D.10 E.11 F.12 G.13 H.16 I.17 DB21/T 3378 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2 024-23448927 2 B-621 024-23447935 DB21/T 33782021 1 辽 宁省松 材线虫病 检验鉴 定技术规 程 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 23476 GB/T 23478 GB/T 35342 3 术语和 定义 3.1 松材线 虫Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer）Nickle Nematoda Secernentea Aphelenchida Aphelenchoidoidea Aphelenchoidoidae Bursaphelenchinae Bursaphelenchus A 3.2 松材线 虫病 3.3 松木及 其制 品 3.4 DB21/T 33782021 2 检验鉴 定 3.5 样品 4 取样 4.1 感病松 树现 地取 样方 法 4-6 8-11 B.2 4.1.1 感病松 树典 型症 状 4.1.2 感病松 树病 症表 现时 间 8 11 4-6 4.2 松木及 其制 品取 样方 法 B.3 5 形态学 鉴定 5.1 分离 C 4h-12h 5.2 镜检 D 5.3 培养 D 5.4 形态特 征 DB21/T 33782021 3 E 5.5 检验记 录 F 6 分子生 物学 鉴定 PCR PCR G 7 样品监 管 7.1 样品保 存 4 1 6 7.2 分子生 物学 检验 样品 送检 H 7.3 样品销 毁 8 检验鉴 定结 果反 馈及 疫情 上报 8.1 检验鉴 定结 果反 馈 10 I 8.2 检验鉴 定结 果确 认 3 8.3 检验鉴 定备 案 3 DB21/T 33782021 4 8.4 疫情上 报 8.5 疫情信 息发 布 DB21/T 33782021 5 A A 附 录 A（资料 性）松材线 虫形 态特 征 2/3 1m 2m A.F.G.H-J.B.C.D.E.DB21/T 33782021 6 B B 附 录 B（资料 性）松材线 虫病 取样 B.1 取样工 具 B.2 现地取 样方 法 B.2.1 取样对 象 1 2 3 4 5 B.2.2 取样数 量 10 10 10 B.2.3 取样部 位 3 B.2.4 取样方 法 100g-200g 100g-200g 2cm B.2.5 样品标 记 B.3 松木及 其制 品取 样方 法 B.3.1 取样对 象 DB21/T 33782021 7 B.3.2 取样部 位和 数量 100g-200g100g-200g 2cm 100g-200g B.3.3 样品标 记 DB21/T 33782021 8 C C 附 录 C（资料 性）常用的 松材 线虫 分离 方法 C.1 贝尔曼 漏斗 法(C.1)10cm-20cm 10cm 1cm-4cm 1cm-3cm 10g 20 20-30 3h-12h 10ml 5ml 30min 1500/min 2min C.2 浅盘法 12h-24h 30min 1500r/min 2min(C.2)图C.1 贝尔曼 漏斗 法装 置图 DB21/T 33782021 9 图C.2 浅盘法 装置 图 DB21/T 33782021 10 D D 附 录 D（资料 性）临时玻 片制 作和 线虫 快速 培养 D.1 临时玻 片制 作 D.1.1 杀死线 虫 5s-6s 60-65 2min-3min D.1.2 玻片制 作 D.2 线虫快 速培 养 D.2.1 疫木保 温保 湿培 养 26-30 3 D.2.2 单异活 体培 养-PDA Botrytis cinerea)Pestalotia spp.)Fusari m spp.)PDA 28 4d-5d 25 4-5 4 30 2 25 1d-3d DB21/T 33782021 11 E E 附 录 E（资料 性）松材线 虫与 拟松 材线 虫形 态特征 的主 要区 别 E.1 松材线 虫典 型形 态特 征 图E.1 松材线 虫典 型形 态特 征 E.2 松材线 虫与 拟松 材线 虫形 态特征 的主 要区 别 B.muctonatus Mamiya et Enda(E.1)表E.1 松材线 虫和 拟松 材线 虫形 态特征 主要 区别 2 m 1 m 3.5 m-5 m DB21/T 33782021 12 F F 附 录 F（规范 性）松材线 虫形 态学 检验 鉴定 记录表 表F.1 松材线 虫形 态 学 检验 鉴定 记录表 注：DB21/T 33782021 13 G G 附 录 G（资料 性）分子生 物学 鉴定 G.1 松材线 虫PCR检测 G.1.1 线虫基 因组DNA 的提 取(200mmol/LTris-HC1 200mmol/LNaC1 100mmol/LEDTA 2%SDS 2%-mercaptoethanol 200g/mL K)10L 1 PCR 70 35min 95 10min 12000/min 2min G.1.2 反应体 系 20L 1 2.0L 10 Taq PCR 2 2L 2.5mmol/L dNTP 3 0.3L Taq 4 1.5L 10mmol/L B 5 2.0L DNA 6 20L G.1.3 反应程 序 98 5s 98 3s 52 3s 72 40s 30 72 2min G.1.4 结果检 测 PCR 1.5%1 TAE 1 TBE 5V/cm 30min 302nm G.1 图 G.1 松材 线虫 电泳 检测 图谱 注：M-DNA 47-49 50-52 G.2 松材线 虫自 动化 分子 检测 DB21/T 33782021 14 G.2.1 松材线 虫病 试剂 盒组 成成 分 DNA A 2 ml/1 DNA B 200l/1 pCR K 500l/1 Taq DNA dNTP PCR P 150l/1 DNA Y 75l/1 DNA C 1ml/1 G.2.2 适用设 备 48 48A mini PCR G.2.3 检测方 法 1.5mL 20L A 20L B 2L 65 40min 95 10min 12000r/min 3min DNA G.2.4 反应体 系 DNA 3.5L K 5L P 1.5L DNA Y 3.5L K 5L P 1.5L C 3.5L K 5L P 1.5L G.2.5 反应程 序 G.2.6 反应结 果 G.1 G.2 表G.1 松材线 虫自 动化 分子 检测 结果 Ct 1 1 A1 25.83 2 1 A2 20.23 3 1 A3 28.47 4 1 A4 23.19 5 1 A5 27.38 6 1 A6 21.28 7 1 16.65 8 1 DB21/T 33782021 15 表G.2 松材线 虫自 动化 检测 结果 G.3 实时荧 光PCR检测 G.3.1 检测仪 器 PCR G.3.2 引物与 探针-GAGCAGAAACGCCGACTT-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-TaqMan-TGCACGTTGTGACAGTCGT-G.3.3 反应体 系 TaqMan PCR G.3.4 反应程 序 95 10min 95 15s 60 35s 35 G.3.5 检测结 果 Cycle threshold value Ct PCR PCR 30Ct 12 Ct 35 Ct 35Ct 30 DB21/T 33782021 16 H H 附 录 H（规范 性）松材线 虫分 子生 物学 检验 送检表 表H.1 松材线 虫分 子生 物学 检验 送检表 注：I DB21/T 33782021 17 附 录 I（规范 性）松材线 虫检 验鉴 定报 告 DB21/T 33782021 18 _
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