资源描述
ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB22/T 29842019 鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法 Double antibody sandwich ELISA method for the detection of deer mucosal disease 2019-05-27发布 2019-06-17实施吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 29842019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：长春市乾艺生物科技研究所、长春市农业科学院。本标准主要起草人：田来明、赵春梅、张宇、李男、田桂华、申雨弘、崔鹤馨、权心娇、胡桂英、付晓霞、王雨千。DB22/T 29842019 1 鹿粘膜病双抗夹心 ELISA 检测方法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，具体防护措施及要求按照 GB 19489 执行。1 范围 本标准规定了鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法的术语和定义、试剂、仪器设备、样品处理、操作步骤和结果判定。本标准适用于鹿粘膜病病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鹿粘膜病 mucosal disease 由病毒性腹泻病毒（mucosal disease virus，MDV）引起的鹿传染病，可引起鹿呈多临床表现，主要表现为腹泻、母鹿流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。4 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。4.1 PBS，见表 A.1。4.2 包被液，见表 A.2。4.3 洗涤液，见表 A.3。4.4 封闭液，见表 A.4。4.5 pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液，见表 A.5。4.6 底物溶液（OPD-H2O2），见表 A.6。4.7 终止液，见表 A.7。4.8 标准阳性，MDV NADL 国际标准株用牛肾继代细胞 MDBK 株培养增值，经反复冻融后制备。4.9 标准阴性，pH7.4 PBS。4.10 MDV 免疫球蛋白，见附录 B。DB22/T 29842019 2 4.11 MDV 酶标抗体，见附录 C。5 仪器设备 5.1 离心机，最高转速 15 000 r/min。5.2 恒温培养箱，温度均匀度1（37 时）5.3 酶联免疫检测仪，全波长酶标仪。5.4 紫外分光光度计，200 nm1 000 nm。6 样品处理 6.1 样品采集 选择新鲜鹿粪 3 g 5 g 装入洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口后立即放入盛有冰块的保温瓶（箱）内。每份样品的包装瓶（袋）上均要贴上标签，写明采集地点，编号，时间等。如暂时不进行检测应80 保存。6.2 样品处理 取 1 g 采集到的鹿粪样品加入10 mL PBS（5.1）中充分混匀，3 000 r/min离心（6.1）30 min，上清液即为待检样品。7 操作步骤 7.1 使用前将所有试剂恢复至室温。7.2 在 ELISA 反应板中加入用包被液（5.2）稀释至1.0 mg/mL MDV 免疫球蛋白（5.10）100 L/孔，37（6.2）包被4 h。7.3 弃去板中溶液，加洗涤液（5.3）300 L/孔，轻微晃动反应板，3 min 后弃去洗涤液；如此操作 3次，最后将 ELISA 反应板置于吸水纸上轻轻拍干。7.4 然后加封闭液（5.4）100 L/孔，37 封闭1 h。7.5 重复 7.3 的操作。7.6 加入待检样品 100 L/孔，并设阳性对照（5.8）2 孔，阴性对照（5.9）2孔，空白对照 1 孔，密封 ELISA 反应板，37 孵育 2 h。7.7 重复 7.3 的操作。7.8 加入酶标抗体（5.11）100 L/孔，密封 ELISA反应板，37 孵育 1 h。7.9 重复 7.3 的操作。7.10 避光环境下，加入底物溶液（5.6）100 L/孔，室温放置 25 min。7.11 加入终止液（5.7）50 L/孔，10 min 内酶联免疫检测仪（6.3）测定结果。8 结果判断 8.1 波长 450 nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。8.2 阴性对照平均 OD 值低于0.05作 0.05计算，高于 0.05 按实际OD 值计算。8.3 阳性对照 OD值 0.8，实验结果有效。DB22/T 29842019 3 8.4 样品 OD 值/阴性对照平均 OD 值 2 判断为阳性，否则为阴性。DB22/T 29842019 4 附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制 PBS pH7.4 配制见表 A.1。表A.1 NaCl 8.0 g KH2PO4 1.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KCI 0.2 g 蒸馏水 加至 1 000 mL 包被液配制见表 A.2。表A.2 NaHCO3 2.93 g Na2CO3 1.95 g 蒸馏水 加至1 000 mL pH调至 9.6，4 保存 洗涤液 pH7.4 配制见表 A.3。表A.3 NaCl 8.0 g KH2PO4 1.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KCI 0.2 g Tween20 0.5 mL 蒸馏水 加至1 000 mL DB22/T 29842019 5 封闭液配制见表 A.4。表A.4 兔血清白蛋白 5 g 洗涤液 100mL pH5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制见表 A.5。表A.5 0.2 mol/L Na2HPO4 25.7 mL 0.1 mol/L 柠檬酸 24.3 mL 蒸馏水 50 mL 底物溶液（OPD-H2O2）配制见表 A.6。表A.6 pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液 100 mL 邻苯二胺 40 mg 30%H2O2 15mL 终止液配制见表 A.7。表A.7 浓硫酸 22.2 mL 蒸馏水 177.8 mL B DB22/T 29842019 6 附 录 B（规范性附录）MDV免疫球蛋白提取 MDV免疫球蛋白提取步骤为：a)取 20 mL MD高免血清，加 20 mL pH 7.4 的PBS，使其稀释 1倍；b)在搅拌条件下缓慢加入 40 mL 的饱和硫酸铵（50%饱和度），4 放置0.5 h 1 h；c)以 3 000 r/min 离心20 min，弃去上清液；d)加入 20 mL PBS，将沉淀充分溶解后再加入 10 mL 饱和硫酸铵（即 33%饱和度），进行第二次沉淀；e)重复 B.4 二次，使沉淀物达到完全白色为止；f)沉淀物溶于 2 mL4 mL PBS 中，装入透析袋中密封；g)再将其放到盛有 PBS 的容器中，于 4 条件下透析过夜脱盐；h)再用 SephadexG-25 进行过柱纯化；i)收集纯化免疫球蛋白，将其用蔗糖浓缩后采用紫外分光光度计进行蛋白含量测定，IgG 含量为 1.28 mg/mL；j)进行分装，-20 保存备用。DB22/T 29842019 7 A C 附 录 C（规范性附录）MDV酶标抗体 MDV酶标抗体的标记步骤为：a)取 10 mg HRP 溶于 1.0 mL 蒸馏水，加入新鲜配制的 0.06 mol/L 高碘酸钠水溶液 1.0 mL，混匀后置冰箱 4 30 min；b)将其取出加入 0.16 mol/L 乙二醇水溶液 1.0 mL，于室温放置 30 min 后加入含 10 mg 纯化MD IgG 水溶液2.0 mL；c)将上述结合物混匀后装入透析袋中在 0.05 mol/L pH 9.5 的碳酸缓冲液中缓慢搅拌透析 6 h使之结合，然后吸出；d)再将吸出物加 5 mg/mL硼氢化钠溶液 0.4 mL，4 放置 2 h；e)将上述结合物混合液加入等体积的饱和硫酸铵，4 放置30 min 后，以 3 000 r/min 离心 20 min，沉淀物溶于少许 0.02 mol/L pH 7.4 的PBS 中，透析过夜；f)再将其在 4条件下 1.5104 r/min 离心 20 min，吸取上清液加入 0.02 mol/L pH 7.4的 PBS 至 10 mL，测定工作效价，酶标抗体的效价为 1:400 倍，酶结合物的摩尔比为 1.40；g)使用时 400倍稀释为 MDV 酶标抗体，-20 保存。_
展开阅读全文