资源描述
ICS 65.020.01 CCS B 60 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3429 2021 蒙古栎SSR 分析技术规程 Technical Regulations of SSR analysis in Quercus mongolica 2021-05-22 发布 2021-06-22 实施 辽 宁 省 市 场 监督管理 局 发布 I 目 次.II 1.1 2.1 3.1 4.1 5.2 6.2 7.2 A.5 B.6 C.7 D.8 DB21/T 3429 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2 024-23448927 12 024-82241813 DB21/T 3429 2021 1 蒙 古栎 SSR 分析技 术规程 1 范围 SRR SSR 2 规 范性 引用 文件 GB/T 28660 SSR LY/T 2426 SSR LY/T 2756 SRAP 3 术 语和 定义 3.1 简单重 复序 列 DNA 1 6 3.2 聚合酶 链式 反应 DNA DNA 3.3 引物 DNA 3-OH DNA DNA 3.4 引物扩 增 多 态性 DNA DNA 4 仪 器设 备及 试剂 DB21/T 3429 2021 2 B 5 引物 C 6 溶 液配 制 D 7 分 析程 序 7.1 分析 材料 DNA-8 7.2 DNA 的提 取 a)CTAB DNA-20 b)510 g 1.5 mL 60 CTAB-65 30 min 10 min 2 3 c)/24:1 10 min 10 000 g 10 min d)1.5 mL c)12 e)2 1.5 mL DNA-30 min f)1.5 mL 10 000 g 10 min g)1 mL1.5 mL 70%10 000 g 10 min 1 h)TE 7.3 DNA 浓度 的 检 测和 定 量 TE-DNA-DNA 7.2 DNA 1%15 min20 min 90 V 325 nm DNA GB/T 28660 DNA 7.4 PCR 反应 7.4.1 PCR 反 应体 系 DB21/T 3429 2021 3 4 1.5 mmol/L Mg2+1.5 mmol/L dNTPs 0.3 mmol/L Taq DNA 0.75 U DNA 5 7.4.2 PCR 反 应程 序 94 5 min 35 94 30 s 30 s(SSR C)72 30 s 72 8 min 4 7.4.3 PCR 产物 的 处理 PCR 7.5 PCR 产物 检测 7.5.1 非变 性 聚 丙烯 酰胺 凝胶 电 泳与 银染 检测 7.5.1.1 玻璃 板的 清洗 2 2 7.5.1.2 胶槽 装配 a)玻璃 板的 固定 b)封胶 1%7.5.1.3 丙烯 酰胺 胶的 配 制 30 mL 8%7.5.1.4 灌胶 LY/T 2756 30 min 7.5.1.5 上样 和电 泳 7.4.3 PCR DNA Marker(DL2000 Marker)200 V 100 mA 1.5 2 h 7.5.1.6 卸胶 DB21/T 3429 2021 4 7.5.1.7 银染 LY/T 2426 7.5.1.8 谱带 记录 DNA Marker SSR SSR PCR SSR 1/0 7.5.1.9 SSR 标记 结果 分 析 Nei 1973 Genetic Similarity,GS 1 unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA SSR 1 GS%Ni i Nj j Nij i j 7.5.2 毛 细管 电泳 荧光 检 测 7.5.2.1 样品 准备 6-FAM HEX PCR 30 2 1 96 0.5 ROX-500 8.5 1 000 g 10 s PCR 3 min 7.5.2.2 收集 数据 96 GeneMapper 3.2 8 分析 和鉴 定 SSR SSR DB21/T 3429 2021 5 附 录 A（资料 性）原理 A.1 原理 SSR SSR PCR SSR PCR SSR PCR DB21/T 3429 2021 6 附 录 B（资料 性）仪器设 备及 试剂 B.1 主要 仪器 设备 PCR/B.2 试剂 Tris EDTA-2Na CTAB RNase A-EB SSR Taq DNA dNTPs Mg2+-DNA DNA Marker APS TEMED)ROX-500 DNA FAX HEX DNA DNA DB21/T 3429 2021 7 附 录 C（资料 性）SSR（简单 重复 序列）标记 引物序 列 表C.1 SSR（简 单重 复序 列）标记 引 物序 列-(bp)N1010265 F:AGACTCTCCGGATGCTCCTT(CAA)9 180-192 5 6-FAM 51 R:ATGCCGAACCCTAACCTCTT N1014482 F:GCCAATGTTGCTGAATTTCC(AAT)6 171-202 5 6-FAM 50 R:TCTAGCATGGACTGACGTGC N1105306 F:TCTTCTTCCAAACCTCGTCG(TTC)7 150-168 5 6-FAM 50 R:GGTTAGAACGGCATCATCGT N1110207 F:GTTCTGTACGAAGGCCGAAG(CAA)8 164-183 5 6-FAM 52 R:CGGTGTTGGAGACACGTAAG N1345390 F:TTAGGAGGCGTGATCGTACC(GAC)7 135-153 5 6-FAM 50 R:AGACGAGCATTTCACAATCG N12361 F:GACACGTCACGACCACTCAC(CAAA)5 139-152 5 53 R:TTACGCAGAATGCCACTGTC N1247890 F:AGGGACACGTGCTCATTAGG(CTTT)6 185-205 5 54 R:CTCTACTCCGATCACTCCGC N1457047 F:AGCACAAGCCAATGTAGAAGC(AAAT)5 156-171 5 50 R:TTTGGACAGCAACAACAACC N4544558 F:TTCTACTCTTGCCCTGGACG(AAT)6 168-182 5 52 R:TAAGGCCTGCAGAGTTGGAC N4529840 F:CCAGCTAAGACGCTCAATCC(TTC)5 200-215 5 51 R:AATCGAAACTCACTCCGTGG DB21/T 3429 2021 8 附 录 D（资料 性）主要试 剂的 配制 D.1 常用 贮备 液 D.1.1 0.5 mol/L EDTA-二钠（pH8.0）溶液 18.61 g 80 mL H2O NaOH pH 8.0 100 mL 4 D.1.2 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液 24.22 g 160 mL HCl pH 8.0 200 mL 4 D.1.3 5 mol/L NaCl 溶液 58.44 g NaCl 160 mL 200 mL 4 D.1.4 CTAB 提 取缓 冲液 2%100 mmol/L Tris-HCl 1 mol/L pH8.0 20 mmol/L EDTA 0.5 mol/L pH8.0 1.4 mol/L NaCl 5 mol/L 500 mL 20 gCTAB 100 mL 1 mol/L Tris-HCl pH8.0 40 mL 0.5 mol/L EDTA pH8.0 280 mL 5 mol/L NaCl 1 L 4 D.1.5 TE（pH8.0）缓冲 液 1 mol/L Tris-HCl pH8.0 1 mL 0.5 mol/L EDTA pH8.0 0.2 mL 100 mL 4 D.1.6 10 mol/L NaOH 溶液 80 g NaOH 160 mL 200 mL D.1.7 EB（1 mg/mL）溶 液 0.05 g EB 50 mL 1 mg/mL D.1.8 6DNA 上样 电泳 缓 冲液(DNA Lording Buffer)0.05%0.05%30 mmol/LEDTA 36%ddH2O DNA DNA D.2 琼脂 糖凝 胶 电 泳溶 液 的配制 1 g 200 mL 50 60 EB 1 mg/mL 1 mm 3 mm5 mm DB21/T 3429 2021 9 D.3 非变 性聚 丙烯 酰胺 凝 胶电泳 溶液 的配 制 D.3.1 40%丙烯 酰胺 贮备 液 380g 20 g 1000 mL,D.3.2 10%过硫 酸铵 溶液 1 g,10 mL 4 D.3.3 10 倍三 羟甲 基氨 基甲烷-硼酸-乙 二胺 四乙 酸缓冲 液（10 TBE 缓冲 液）Tris 108 g 55 g 0.5 mol/L EDTA pH8.0 40 mL 1000 mL D.3.4 8%非变 性聚 丙烯 酰 胺工作 液 40%10 mL 10%35 mL 4 D.4 银染 试剂 配制 D.4.1 固定/脱 色液 100 mL 1000 mL D.4.2 硝 酸银 染色 液 3 g 500 mL 1.6 mL 37%D.4.3 氢 氧化 钠显 影液 10 g 500 mL 4 30 min 2 mL 37%_
展开阅读全文