植物组织培养室组建及操作技术规程DB13／T 5110-2019.pdf

ICS 65.020.40 B 61 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 51102019 植物组织 培养室组 建及操作 技术规程 2019-11-28 发布 2019-12-28 实施 河 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB13/T 5110 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由河 北农 业大 学提 出。本标准 起草 单位：河 北农 业大学。本标准 主要 起草 人：师校 欣、杜 国强、高仪、王莉、杨丽 丽、王燕 霞、刘婉 君、李 宝鑫。DB13/T 5110 2019 1 植 物组织 培养室组 建及操 作技术规 程 1 范围 本标准 规定 了 植 物组 织培 养室 组 建及 操作 技术 的 选 址、设施 设备 与试 剂，室 内 环境，培 养基 制备，基本操 作，消 毒 灭菌 与日 常管理 等要求。本标准 适用 于 植 物组 织培 养研究 实验 室及 组培 快繁 育苗工 厂组 建及 常规 操作。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文 件，仅 注日 期的版 本适 用于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB 28232 臭氧 发生 器安 全与卫 生标 准 LY/T 1882 林 木组 织培 养 育苗技 术规 程 NY/T 2306 花 卉种 苗组 培 快繁技 术规 程 DB13/T 2596 苹果 组培 苗 繁育技 术规 程 3 选址、设施 设备 与试 剂 3.1 选址及 组成 植物组 织培 养室（或 组培 工厂）选址 应环 境清 洁，远离微 粒和 烟雾 等 污 染源，水电 供应 充足，交通运输 便利。植物组 织培 养室（或 组培 工厂）应包 括培 养基 制备 室、洗 涤室、灭 菌室、接 种室、培养 室、储 藏室、研 究室 以及 温室 或大 棚 等8 部分。其空 间大 小和 装备程 度可 根据 培养 目的、规模、工作 人数、经 费和资源 状况 确定。应 配置 合理，工作 方便，使 用安 全，节 省能 源。各部 分比 例大小 和设 备规 模可 参 考附录A。3.2 设施设 备 3.2.1 培养基 制备 室 应有适宜 的 空间 和 配 套的 工作台，便 于多 人同 时操 作。配 备冰 箱、电子 分析 天平、电子 秤、酸度计、磁力 搅拌 器、净水 器 或蒸馏 水器、电磁 炉、培 养基灌 装机 等仪 器设 备；配置 不 锈钢 锅、培 养 瓶（三角瓶、试管、罐 头瓶、耐 高温塑 料组 培专 用瓶）、培养皿、透 明及 棕色 试剂 瓶、烧 杯、容量 瓶、量 筒、移液管、移 液管 架、微量 移液器、玻 璃棒、记 号笔、封口 材料（棉 塞、牛皮 纸、组 培专 用透 气封口膜或组培 专用 透气 瓶盖）、棉线绳、pH 试纸、周 转筐、蒸馏 水桶、小 推车 等用 品和用 具；配备 器械 柜、药品柜、危 险品 柜，分别 存放接 种工 具和 分类 存放 化学试 剂。3.2.2 洗涤室 应地面 和水 槽处 的墙 面防 水 耐湿、平 整光 滑易 清洁。配置 大型 水槽、工 作台、超声 波仪、烘箱、塑料盆、塑 料周 转筐、毛 刷、洗 衣粉 和洗 洁精 等。3.2.3 灭菌室 DB13/T 5110 2019 2 应 配备 合理 专用 输电 线路，施工 规范；配 置空 调、换气扇 等通 风设 备；高压 蒸汽灭 菌器、干 热 消毒柜或 恒温 干燥 箱（烘箱）、周 转筐 及小 推车 等 设 备或工具。工作规 模较 小、空间 紧张 时，洗 涤室 可 与 灭菌 室合 并。3.2.4 接种室 接种室 外侧 设置 缓冲 间，或将一个 房 间隔 断成 两部分，外 部小 空间 作缓 冲间，内部 大空 间做 接 种室。外界 与 缓冲 间的 门、缓冲间 与接 种室 的门 应错 开，建 议采 用 滑 动门。缓 冲间 配 备紫 外线 杀菌灯、洗手池、鞋 架、衣帽 钩、工作服、工 作帽、口 罩等，用于 无菌 操作 前 洗 手、更衣、换鞋。有 条件 的 单位可在 接种 室门 口设 置 风 淋室。接种 室要 求 门 窗密 封 防尘 性能 好，地面 和墙 壁平整 光滑，便 于清洁 和消毒。配套 的 电 源插 座 布 局合理。配 置紫 外 线 杀菌 灯、臭氧 发 生器、超 净工 作台、空调、接 种器 具 灭菌器、广 口 瓶（盛放70%乙醇，用于 浸泡 接种 工具）、酒精 灯、打火 机、接 种 工具（枪 状镊、手术 刀、手术剪 等）、小 推车、解 剖镜、纱布、手 持喷 雾器 等。3.2.5 培养室 培养室 门窗、地 面和 墙面 的要求 同3.2.4 接种 室，另外 要 求保 温性 能好。配 备 光照 培养 架、光 照培养箱、暗 培养 橱、震荡 培养器（摇 床）、光 照控 制系统、空 调、暖气、除 湿机、空气 消毒 器、紫外线 杀菌 灯、臭氧 发生 器、温 湿 度记 录 仪等。光 照 培养 架 设56 层，最低 层距地 面20 cm，层 间距30 cm左右，架长 依40 W日光灯管的长度决定，一般130 cm，架 宽60 cm 左右，每层架面安装23支日光灯 或组培专 用LED 特 定光 谱灯，用自动 定时 器控 制 光 照周 期。培养材 料固 体培养 时 摆放 在培养 架上，也 可置 于 光 照培养 箱 中 方便 设定 不同 的培养 条件。需要黑暗培养 的材料，放置 在 暗 培养 橱 中培 养。培养 材料 液体培 养 时，用 震荡 培养 器。3.2.6 储藏室 应 干燥、通 风、防火。配 置橱柜、储 物架，便 于物 品存放 整齐 有序。3.2.7 观察室 配置计 算机 及软 件、图像 拍摄设 备等。3.2.8 驯化移 栽场 地 选用有 防虫 网或 防虫 设施 的温室 或大 棚，用于 组培 材料的 瓶外 扦插 生根 和已 生根试 管苗 的驯化移栽。棚室配 置苗床、弥雾 增湿 装置、遮阳 网、塑料 薄膜、小拱 棚架；营 养钵 或穴 盘等 移 栽容 器；营 养土、草 炭、蛭石 等移 栽基 质；多 菌灵 等杀 菌药 剂。3.3 试剂 3.3.1 消毒灭 菌 剂 乙醇、次氯 酸钠、84 消毒 液、氯 化汞、新 洁尔 灭、抗 生素、甲 醛、高锰 酸钾 等。3.3.2 无机盐 和有 机 营 养成 分 不同植 物种 类组 织培 养时 适宜的 基本 培养 基种 类及 配方不 同，常用 的基 本 培 养基 配 方中 无机 盐 和有机营养 成 分见 附录B。糖 类多用 蔗糖，为 降低 成本 可用 食 用白 砂糖 代替。其 它还有 葡萄 糖、果糖、麦芽糖、山梨 醇、半乳 糖、乳糖、甘露 糖等。DB13/T 5110 2019 3 3.3.3 植物生 长调 节物 质 细胞分 裂素：6-苄基 腺嘌 呤（6-BA）、激 动素（KT）、玉 米素（ZT）、2-异 戊烯腺 嘌呤（2ip）、苯基噻 二唑 基脲（TDZ）等。生长素：吲 哚丁 酸（IBA）、吲哚 乙酸（IAA）、萘 乙 酸（NAA）、2,4-二氯 苯 氧乙酸（2,4-D）等。赤霉素：GA3 等。生长延 缓剂：矮 壮素（CCC）、丁 酰肼（B9）、多效 唑（PP333）等。3.3.4 固化剂 常用琼脂，其它 还可 用 琼 脂糖、卡拉 胶、吉兰 糖胶 等。3.3.5 培养基 附加 成分 根据培 养目 的选 择使 用，常用的 培养 基附 加成 分有 活性炭、水解 乳蛋 白（LH）、水解 酪蛋 白（CH）等。4 室内环 境 4.1 温度 培养室 温度 应根 据培 养材 料种类 和培 养目 的，设 定 并调节 在最 适温 度范 围。一般情 况下，25 2 可满 足 多种 植物 组织 培 养对温 度的 要求。4.2 光照 4.2.1 光照强 度 一般培 养室 光照 强度 控制 在1000 Lx 5000 Lx，可根 据不同 培养 物及 不同 培养 阶段的 需光 特性 调 整光照强 度；工厂 化生 产时，为降 低成 本可 考虑 利用 自然光 照。4.2.2 光质 培养室 通常 装配 日光 色荧 光灯，也 可装 配组 培专 用LED 灯，降 低能 耗，可 根据 培 养植物 的需 求选 用适宜的 单色 光质 或复 合光 质。4.2.3 光照周 期 根据培 养 材 料对 光周 期的 要求 设 定并 调节，常用 的光 照周期 是每 天12 h16 h 光 照，8 h 12 h黑暗，用 自动 定时 器 控 制。4.3 湿度 培养室 的相 对湿 度一 般控 制在60%以内，超 过 时用 除湿设 备除 湿。5 培养基 制备 培养基 母液 及培 养基 配制 按DB13/T 2596 中5.2、5.3 执行。DB13/T 5110 2019 4 6 基本操 作 6.1 清洗 普通器 皿用 洗涤 剂洗 涤后，用自 来水 冲洗；新 购入 器皿，先用 水清 洗，再用1%盐酸 浸泡2 h3 h，最后清 水冲 洗。严 重污 垢 难清洗 器皿，水洗 后用4%重铬酸 钾洗 液浸 泡，最 后 清水冲 洗。小 件难 清洗 器皿亦可 用超 声波 仪清 洗。染菌器 皿必 须经121 高 压 蒸汽灭 菌后，倒掉 污物 洗 涤。洗净 的器 皿应 内外 壁水膜均 匀，不挂 水珠，口 朝下常 温晾 干或 放入 烘箱 烘干。6.2 灭菌 与 消毒 6.2.1 物理灭 菌 6.2.1.1 湿热灭 菌 适用于培养 基、蒸馏水、接种器具等，常用高压蒸汽灭菌，在0.1 MPa 压力下，即121，培养 基灭菌15 min 20 min，其 余 物品30 min。6.2.1.2 干热灭 菌 适用于 玻璃 器皿 及金 属器 械，可将 物品 用牛 皮纸 或 布袋 包 扎好，置于 恒温 干 燥箱（烘 箱）中，160 灭菌2 h 3 h。6.2.1.3 灼烧灭 菌 适用于金属接种 器 具，先将镊子、剪子、解剖刀等浸入70%乙醇中，取出后在 酒精灯火焰外 焰灼烧1 min 左右，或将其尖端部分烧红为止；也可用280 320 接种器具 灭菌 器灭菌1 min 2 min，省时、安 全。6.2.1.4 过滤除菌 溶液通 过0.22 m 滤膜 过滤，杂 菌被 阻，从而 实现 无 菌。过滤 除菌 适用 于高 温 不稳定 的物 质，如 部分植物 生长 调节 剂（赤霉 素、玉 米素、吲 哚乙 酸）、抗生 素等。6.2.1.5 射线灭菌 常用于 接种 室、培养 室 等 环境的 灭菌，用260 nm紫 外线 灯 照射20 min 30 min。6.2.2 化学灭 菌 6.2.2.1 浸泡灭菌 用于外 植体 材料 的 表 面灭 菌，常 用的 灭菌 剂有70%乙醇20 s 30 s、5%次 氯酸 钠（2 min 20 min）、84消毒 液（稀释2 5 倍，5 min 20 min）、0.1%氯化 汞2 min 15 min，有 剧毒、尽量 少用）。消毒 剂中常加 入0.1%表面 活性 剂 吐温-20 或 吐温-80，增强 灭菌效 果。6.2.2.2 喷雾灭菌 常用70%乙 醇在 接种 室、培养室 等 场 所进 行 喷 雾降 尘及 消 毒和 灭菌。6.2.2.3 擦拭灭菌 常用70%乙醇 擦 拭接 种人 员双手 或桌 面、超净 工作 台台面，用84消 毒液、2%新洁尔 灭拖 擦地 面。DB13/T 5110 2019 5 6.2.2.4 熏蒸灭菌 利用 设 备直 接放 出 杀 菌气 体或用 氧化 方法 将化 学试 剂变为 气体 扩散 到空 气中 杀灭微 生物，如 臭氧发生器 释放 臭氧（O3）、甲 醛氧化 熏蒸 等方 法。其 中 甲醛氧 化熏 蒸的 效果 好，但对人 体和 环境 毒性 大，不提倡 常规 使用。具 体操 作方法 见附 录C。6.3 无菌接 种操 作 及 注意 事项 6.3.1 对缓冲 间和 接种 室全 面清 洁，紫 外灯 照射 灭菌。6.3.2 操 作人 员在 接种 室的 缓冲 间更衣 洗手。接 种专 用衣、帽、鞋 要每 周清 洗，保 持洁净，定 期消 毒和灭菌。6.3.3 打开超 净工 作台 和台 上的 紫外灯，20 min 30 min 后 关闭紫 外灯 上机，利 用超 净工作 台 提 供的无菌环 境接 种。将纱 布用70%乙 醇浸 湿，擦拭 双 手、超净 工 作台 台面 及内壁，或用手 持喷 雾器 喷 洒 70%乙醇。6.3.4 刀、镊、剪 等接 种工 具用70%的 乙醇 浸泡 或擦 拭，再用 电热 接种 器具 灭菌 器或 酒精 灯 灼烧 灭菌后，置器 械架 或搁 置台 上 冷却至 常温。注意 接种 工 具尖端 不要 碰到 器械 架或 搁置台，工具 每使 用一 次，均需重 新灭 菌，防止 交叉 污染。6.3.5 将已灭 菌的 外植 体 或 无菌 组培材 料 在 培养 皿或 不锈 钢盘中 切分 成合 适大 小。培 养皿或 不锈 钢 盘需事先 高温 灭菌，每 接种 一瓶试 管材 料要 更换 一个 无菌的 培养 皿或 不锈 钢盘。6.3.6 一只手 倾斜 持握 培养 瓶，另一只 手的 小指 与无 名指 指缝（或 无名 指与 中指 的 指缝）夹 住培 养瓶的棉塞 或封 口膜，慢 慢打 开并始 终夹 在手 中（培养 瓶盖可 里面 朝上 放置 于工作 台面），用镊 子夹 取 切分好的 材料，以 植物 材料 的形态 学下 端插 入培 养基，深度 以材 料可 牢固 竖立 为宜，单芽 茎段 的芽 体 要露出培 养基，接 种叶 片或 叶块则 平铺 在培 养基 表面。6.3.7 封 好瓶 口，标明 材料 名称、接种 日期、处 理方 法等，放置 培养 室培 养。6.3.8 无菌操 作期 间，应 经常 用 70%乙 醇擦 拭工 作台 面和 双 手。接种 时戴 口罩，头部 及 身体不 可探 入台内，并注 意手 臂不 得在 培养基、无 菌材 料、接种 器械上 方经 过，手臂 离开 工作台 后再 次进 入时 需 重新消毒。已 灭菌 的外 植体、试管 苗、接种 工具 以及 封口材 料接 触瓶 口的 部分 等不得 接触 双手、工 作 台面和器 皿外 壁等，防 止造 成污染。6.3.9 接种完 毕，及时 清理 工作 台面和 用具。关 闭超 净工 作台。7 消毒灭 菌 与 日常 管理 7.1 接种室 7.1.1 按照 每15 m2配置1 根 30 w 紫外灯 的标 准，每天 用紫 外灯照 射杀 菌1 h，每周 用 臭氧 发 生器 消毒 23 次，臭 氧浓 度应 20 mg/m3，作用 时间 应 30 min（按 GB 28232 执行）。杀菌 时人员 切 勿进入，注 意安 全。也可 使用 空气净 化器，每 3 个 月更 换一次 滤芯。7.1.2 组培室 污染 率居 高不 下、一般消 毒灭 菌措 施难 以控 制时可 用甲 醛熏 蒸的 办法。甲醛（40%）用量 4 ml/m38 ml/m3，高锰 酸钾用量 2 g/m34 g/m3，在接 种 室地 面中 央放 置耐 热、耐 腐蚀 敞口 容器，先放入 高锰 酸 钾，再 加入 甲醛溶 液，操作 人员 立即 撤离，将房 间密 闭。3 d 5 d 后，充 分通 风。DB13/T 5110 2019 6 7.1.3 其余 按DB13/T 2596 中相 关要求 执行。7.2 培养室 7.2.1 每周用 紫外 灯照 射杀 菌 1 h，每月 用 臭 氧消 毒 1 次；或使用 空气 净化 器，每 3 个月更 换一 次 滤芯。甲 醛熏 蒸具 体要 求 同7.1.2。7.2.2 其余 按DB13/T 2596 中相 关要求 执行。7.3 培养基 制备 室、洗涤 室、灭菌室、工 作区 域走 廊 按DB13/T 2596 中相 关要 求 执行。DB13/T 5110 2019 7 附 录 A（资料 性附 录）组培室 各功 能区 面积 比例 及设计 说明 组培室 各功 能区 面积 比例 及设计 说明 见表A.1。表A.1 组培 室 各 功能 区面 积比例 及设 计说 明 组培室功能区 面积（m2)设备说明 培养基制备室 40 放置 2 个4 m 1.3 m 操作台 洗涤室 10 配置 4 m 长、6 个水龙头洗涤槽 灭菌室 10 放置 3 台高压蒸汽灭菌器，每 台功率 2000 w，配置专用输电 线路 接种室 40 配置 10 台超净工作台，配置相 应电源插座 缓冲间 2 3 配置衣帽钩、鞋架，洗手池等 培养室 80 配置 1.3 m 0.6 m 培养 架 24 个，光照培养箱12 个、暗培养 箱 2 个，摇床4 个 储藏室 20 配置橱柜 观察室 20 配置计算机和图像采集设备 驯化移栽场地 500 配置苗床、遮阳设施 DB13/T 5110 2019 8 附 录 B（资料 性附 录）常用培 养基 基本 成分 表 常用培 养基 基本 成分 表见表B.1。表B.1 常用 培养 基基 本 成分 表 单位：mg/L 培养基成分 Murashige 和 Skoog MS(1962)GamborgB5(1968)朱至清 N6(1975)赵惠祥 AS(1982)Nitsch NN69(1969)McCown 和Lloyd WPM(1980)KNO3 1900 2500 2830 950 950-K2SO4-990 NH4NO3 1650-825 720 400(NH4)2SO4-134 463-M g S O 4 7 H 2 O 370 250 185 185 185 370 KH2PO4 170-400 85 68 170 NaH2PO4 H2O-150-C a C l 2 2 H 2 O 440 150 166 220 166 96 Ca(NO3)2 4H2O-556 N a 2 E D T A 2 H2O 37.3 37.3 37.3 18.6 37.3 37.3 F e S O 4 7 H 2 O 27.8 27.8 27.8 13.9 27.8 27.8 M n S O 4 4 H 2 O 22.3 10.0 4.4 2.23 25.0 22.3 Z n S O 4 7 H 2 O 8.6 2.0 1.5 1.05 10.0 8.6 H3BO3 6.2 3.0 1.6 0.62 10.0 6.2 KI 0.83 0.75 0.8 0.083-N a 2 M o O 4 2 H 2 O 0.25 0.25-0.025 0.25 0.25 C u S O 4 5 H 2 O 0.025 0.025-0.0025 0.025 0.25 C o C l 2 6 H 2 O 0.025 0.025-0.0025-VB1 0.1 10.0 1.0 0.4 0.5 1.0 VB6 0.5 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 烟酸 0.5 1.0 0.5 0.5 5.0 0.5 甘氨酸 2.0-2.0 0.2 2.0 2.0 肌醇 100 100-10 100 100 叶酸-0.5-生物素（VH）-0.05-水解乳蛋白LH-250-蔗糖 30000 20000 50000 30000 20000 20000 _