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ICS 65.060.25 B 10/14 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4049 2020 种鸡鸡毒 支原体和 滑液囊支 原体病净 化技术规范 Technical criterion for eradication of mycoplasma gallisepticum and mycoplasma synoviae in breeder flock 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4049 2020 I 前 言 GB/T 1.1 2009 DB37/T 4049 2020 1 种 鸡鸡毒 支原体和 滑液囊 支原体病 净化技 术规范 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 17999.4 SPF 4 SPF NY/T 553 PCR NY/T 1168 NY/T 5030 DB34/T 2160 DB63/T 1652 T/CVMA 1 OIE 3 术语与 定义 3.1 种鸡 breeding chicken 3.2 家禽疫 病净 化 poultry disease eradication DB37/T 4049 2020 2 4 诊断 4.1 临床诊 断 4.1.1 鸡毒支 原体 病 DB34/T 2160 4.1.2 滑液囊 支原 体病 4.1.2.1 流行特 点 4 16 5%10%10%4.1.2.2 临床症 状 4.1.2.3 病理变 化 4.2 病原分 离培 养 OIE 4.3 血清学 检测 GB/T 17999.4 2 min 2 min B 4.4 核酸检 测 PCR LAMP 4.4.1 试剂 4.4.1.1 GB/T 6682 4.4.1.2 2 Taq PCR MasterMix 4.4.1.3 10 LAMP Amplification Buffer-20 4.4.1.4 10 mmol/L Betaine A.1-20 DB37/T 4049 2020 3 4.4.1.5 Bst DNA Polymerase 6 U/L-20 4.4.1.6 MgSO4(100 mmol/L)A.2-20 4.4.1.7 dNTP(10 mmol/L)-20 4.4.1.8 SYBR Green 4 4.4.1.9 DNA Marker 2000-20 4 3 4.4.1.10 DNA 4 4.4.1.11 MG F-36 MS GX11-T 4.4.2 仪器设 备 4.4.2.1 PCR 4.4.2.2 12 000 r/min 4.4.2.3 2 L 10 L 100 L 200 L 1 000 L 4.4.2.4 0.01 mg 4.4.2.5 4.4.2.6 4.4.2.7 4.4.2.8 4.4.2.9 4.4.3 样品处 理 1 mL PBS 4.4.4 DNA 提取 4 000 r/min 5 min 1.5 mL 4 12 000 g 20 min 25 L 50 L 0.1%(DEP)DNA DNA 4.4.5 聚合酶 链式 反应（PCR）方法 PCR NY/T 553 4.4.6 环介导 等温 扩增 技术（LAMP）方 法 4.4.6.1 引物 MG mgc2 MS 16S rRNA LAMP 200 bp MG-F3 5-ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3 MG-B3 5-CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3 MG-FIP 5-ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3 MG-BIP 5-TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3 MS-F3 5-GCATTAAGCGGATCGGTT-3 MS-B3 5-AACTGCTGCATCAAGAGC-3 MS-FIP 5-TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3 MS-BIP 5-ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3 DB37/T 4049 2020 4 4.4.6.2 LAMP 反应 条件 1 表1 禽支原 体LAMP 反应 体系 lification buffer 2.5 L dNTP(10 mmol/L)4.0 L F3/B3(10 0.5 L FIP/BIP(30 1 L Betaine(10 mmol/L)2 L DNA 1 L BstDNAPolymerase(6 L)1 L MgSO4(100 mmol/L)1 L ddH20 10.5 L DNA 1-5 L/LAMP 1 mL 1 000 SYBR Green 63 60 min 80 10 min 4.4.6.3 结果判 定 LAMP SYBR Green LAMP C 5 净化检 测规 程 5.1 曾祖代 和祖 代鸡 5.1.1 出壳雏 鸡的 检测 与处 置 5.1.1.1 雏鸡饲 养管 理 T/CVMA 1 5.1.1.2 样品的 收集 1.5 mL 0.5 mL 5.1.1.3 核酸检 测和 病原 鉴定 PCR LAMP PCR NY/T 553 PCR LAMP 4.4.6 PCR LAMP DB37/T 4049 2020 5 OIE 5.1.1.4 检测鸡 群处 置 PCR LAMP PCR LAMP 5.1.2 育成期 的检 测和 处置 5.1.2.1 鸡群临 床观 察 4.1.1 4.1.2 5.1.2.2 抗体检 测 100%SPA 5.1.2.3 可疑鸡 群病 原核 酸检 测 PCR LAMP 5.1.2.4 检测鸡 群处 置 PCR LAMP 5.1.3 开产前 鸡群 的检 测和 处置 5.1.3.1 鸡群临 床观 察 4.1.1 4.1.2 5.1.3.2 抗体检 测 5.1.2.2 5.1.3.3 可疑鸡 群病 原核 酸检 测 5.1.2.3 5.1.3.4 检测鸡 群处 置 PCR LAMP 5.1.4 留种前 的预 防用 药和 检测 以及处 置 5.1.4.1 鸡群临 床观 察 4.1.1 4.1.2 5.1.4.2 鸡群检 测 DB37/T 4049 2020 6 100%5.1.2.2 5.2.2.3 PCR LAMP 5.1.4.3 预防用 药 2 7.2 5.1.5 种蛋的 选留 和孵 化 5.1.1 5.1.4 1 45 14 h 5.2 父母代 5.2.1 雏 鸡的 检测 和处 置 5.1.1.2 PCR LAMP PCR LAMP 5.2.2 育成期 鸡群 的检 测和 处置 5.1.2 5.2.3 开产前 鸡群 的检 测和 处置 5.1.3 5.2.4 留种前 的预 防用 药和 检测 以及处 置 5.1.4 5.2.5 种蛋的 选留 和孵 化 5.2.1 5.2.4 6 净化周 期启 动和 终止 6.1 检测时 间的 选择 5.1.1 5.1.4 5.2.1 5.2.4 6.2 净化标 准评 估 D DB37/T 4049 2020 7 6.3 净化后 检测 比例 的调 整 6.2 5.1.1 5.1.4 5.2.1 5.2.4 10%6.2 5.1.1 5.1.4 5.2.1 5.2.4 7 注意事 项 7.1 生物安 全 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 7.1.5 7.1.6 7.1.7 2 3 7.1.8 7.1.9 NY/T 1168 DB63/T 1652 7.2 药 物的 预防 7.2.1 NY/T 5030 7.2.2 7.2.3 8 档案管 理 LAMP PCR D 2 DB37/T 4049 2020 8 A A 附 录 A（资料 性附 录）试剂的 配制 A.1 10 mmol/L Betaine 溶液 Betaine 1.171 5 g 10 mL 1 mol/L 10 L DEPC 1 mL 10 mmol/L Betaine A.2 100 mmol/L MgSO4 MgSO4.7H2O 0.246 g 1 L DB37/T 4049 2020 9 B B 附 录 B（资料 性附 录）血清平 板凝 集试 验判 定标 准 B.1 图B.1 血清平 板凝 集试 验结 果判 定标准 对照 图（左为 阳性，中为 可疑，右 为阴 性）DB37/T 4049 2020 10 C C 附 录 C（资料 性附 录）LAMP 反应 结果 判定 C.1 可见光 下LAMP 反 应结 果判 定 图C.1 可见光 下 LAMP 反应 阳性（绿色荧 光）与阴 性（橙黄 色）对 照图 C.2 紫外光 下LAMP 反 应结 果 图C.2 紫外光 下 LAMP 反应 阳性（绿色荧 光）与阴 性（无荧 光）对 照图 DB37/T 4049 2020 11 D D 附 录 D（资料 性附 录）鸡毒支 原体 病和 滑液 囊支 原体病 净化 评估 标准 D.1 净化标 准评 估 0 1%D.2 抽检要 求 D.2.1 血清学 评估 150 GB/T 17999.4 2008 SPA 1%1%D.2.2 病原学 评估 3%5%PCR LAMP DB37/T 4049 2020 12 E E 附 录 E（资料 性附 录）种鸡群 净化 记录 表 表E.1 种鸡群 净化 鸡毒 支原 体检 测记录 表 1/2 W MG MG SPA PCR LAMP DB37/T 4049 2020 13 表E.2 种鸡群 净化 滑液 囊支 原体 检测记 录表 2/2 MS MS SPA PCR LAMP _
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