猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT－PCR检测方法DB33／T 2246-2020.pdf

ICS 65.020.20 B 44 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2246 2020 猪流 行性乙型 脑炎病毒 荧光定量RTPCR 检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020-03-03 发布 2020-04-03 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 2246 2020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规定编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：谢荣辉、张传亮、吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。DB33/T 2246 2020 1 猪流行 性乙型 脑炎病 毒荧光定 量 RT PCR 检测 方法 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）荧光定量RTPCR检测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。2 术语和 定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 猪 流行 性乙 型脑 炎 由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公猪睾丸炎。3 实验条 件 3.1 仪器 3.1.1 高速冷冻离心机。3.1.2 荧光定量PCR仪。3.1.3 生物安全柜。3.1.4 组织研磨仪。3.1.5 微量移液器。3.1.6 冰箱。3.1.7 涡旋混匀器。3.1.8 高压灭菌器。3.2 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。3.2.1 Trizol：核糖核酸（Ribonucleic acid,RNA）提取试剂。3.2.2 氯仿：4 预冷。3.2.3 异丙醇：4 预冷。3.2.4 焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate,DEPC）水：取 DEPC 100 L，加超纯水至 100 mL，室温过夜，121 高压灭菌15 min，分装，冻存备用。3.2.5 75%乙醇：用75 mL无水乙醇，加DEPC 水至 100 mL，混匀，20 预冷。DB33/T 2246 2020 2 3.2.6 商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂：One Step Prime Script RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 2One Step RT-PCR Buffer、Ex Taq HS（5 U/L）、PrimeScript RT Enzyme Mix 和无RNA酶的水。3.2.7 0.01mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）：取 Na2HPO4.12H2O 2.9g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g,NaCl 8g,溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至7.4，然后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌30 min，室温保存。3.2.8 引物和探针，其序列如下：上游引物：5GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针：5FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。3.2.9 阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2 株）。4 操作步骤 4.1 样品采 集 4.1.1 脑组织：选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组织装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检或-20 以下保存备用。4.1.2 全血：用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检。若不能及时送检的全血，应分离血清置于-20 以下保存备用。4.2 样品处理 4.2.1 取待检脑组织适量装入到无菌离心管中，按1：10体积加入PBS，置于组织研磨仪中充分研磨。将研磨后的样品，反复冻融 3 次，10000 r/min 离心 5 min，取上清液至无菌离心管中，编号待检。4.2.2 取全血 3500 r/min离心5 min，取血清至无菌离心管中，编号待检。4.3 RNA 提取 4.3.1 按下列步骤完成RNA提取，也可采用商品化的病毒RNA提取试剂盒。4.3.2 取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离心管进行编号。4.3.3 每管加入750 L Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250ul,震荡数次，静置5 min。再加入200 L预冷的氯仿，震荡混匀，静置5 min，于4 C 12 000 r/min 离心 15 min。4.3.4 取与本标准 5.3.2 中相同数量的灭菌1.5ml离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准5.3.3中离心后的上清液（注意不吸出中间层）转移至相应的管中，加入等体积异丙醇，混匀，20 C 静置30 min。4.3.5 于4 C 12 000 r/min离心 15 min，弃上清，缓缓加入 1 mL 75%乙醇，颠倒洗涤沉淀及管壁。于4 C 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，室温条件下干燥后，加入 30 L DEPC 处理水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以 4 000 r/min离心10 s,冰上保存备用。提取的RNA应在 2 h内进行荧光 RT-PCR扩增，若需长期保存，需置于-70 C 冰箱保存。4.4 荧光定 量 RT PCR 反应 4.4.1 反应体 系组 成 设立阳性对照、阴性对照，反应体系（20L）由表1中物质组成。DB33/T 2246 2020 3 表1 反应体 系配 制表 试剂 用量L 2One Step RT-PCR Buffer 10 Ex Taq HS（5 U/L）0.4 PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 上游引物（10 mol/L）0.4 下游引物（10 mol/L）0.4 探 针(10 mol/L)0.4 样品RNA 4 RNase Free dH2O 4 总 量 20 4.4.2 反应条 件 反转录：42 15 min；预变性：94 2 min；扩增：94 10 s，60 40 s，45个循环，60 时设置采集荧光。4.4.3 荧光素 的设 定 Report Dye 设定为FAM，Quencher Dye设定为none。5 结果判 定 5.1 结果分 析条 件设 定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。5.2 质控标 准 阳性对照的Ct值应 30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值且无典型扩增曲线，二者同时成立可判定试验成立，否则试验无效。5.3 结果描 述及 判定 5.3.1 阴性判定 无Ct值，且无典型扩增曲线，判为阴性。5.3.2 阳性判定 Ct值35，且出现典型扩增曲线，判为阳性。5.3.3 可疑判定 Ct值35，且出现典型扩增曲线的样品，需重复检测；重复检测结果Ct值38且出现典型扩增曲线的判为样品阳性，否则判为阴性。