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ICS 65.020.20 B 31 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3775 2020 猪繁殖与 呼吸综合 征病毒 RT-LAMP 检测 方法 RT-LAMP method for Detectiong Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus 2020-04-08 发布 2020-05-15 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 37752020 I 目 次 前 言.1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 缩略 语.1 4 原理.1 5 试剂 和仪 器设 备.2 6 操作 程序.2 7 结果 判定.4 8 安全 和防 污染 措施.4 附 录 A（规 范性 附录）试 剂的 配制.5 附 录 B（资 料性 附录）.6 DB32/T 37752020 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出的 规则 起草。本标准 由南 京农 业大 学提 出 并归 口。本标准 起草 单位：南 京农 业大学。本标准 主要 起草 人：姜平、张日 腾、白娟、熊 富强、王先 炜、李玉 峰、陈闻。DB32/T 37752020 1 猪 繁殖与 呼吸综合 征病 毒 RT-LAMP 检 测方法 1 范围 本标 准规定了猪 繁殖与呼吸综 合征病毒RT-LAMP 检测原 理、试剂和 仪器设备、检 测程序和结 果判定。本标准 适用于 猪临 床样品（肺脏、脾脏 和血 清）和 细胞培 养物中 猪繁 殖与呼 吸综合 征病毒 的检 测；同时适 用于 猪繁 殖与 呼吸 综合征 病毒 经典 型、高致 病 性、类NADC30型三 种 基因亚 型的 分型 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 版）适用 于本 文件。GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 GB/T 27401 实验 室质 量 控制规 范动 物检 疫。NY/T 541 兽 医诊 断样 品 采集、保存 与运 输技 术规 范 SN/T1193 基因 检验 实验 室技术 要求 3 缩略语 PRRSV:porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪繁 殖与 呼吸 综合 征 病毒 LAMP：loop-mediated isothermal amplification,环介 导的恒 温扩 增 RT-LAMP：Reverse transcription,loop-mediated isothermal amplification，反转录 环介导 的恒 温扩 增。4 原理 猪繁殖 与呼 吸综 合征 病毒（PRRSV）主 要引 起猪 繁 殖与呼 吸综 合征(俗 称蓝 耳病)。该病 毒有 美洲型和欧 洲型 两个 血清 型。美洲型 又有 多个 基因 亚型。我国 流行 的美 洲型 PRRSV 主 要有 传统 型、高致 病性和 类 NADC30 型毒 株，其主要 区别 存在 于病 毒 的 Nsp2 基因。环 介导 的恒 温 扩增（LAMP）是 一种 体外恒温 核酸 扩增 技术，用 于快速 检 测 DNA。RT-LAMP 是 一种 逆转 录 LAMP，用于 检 测 RNA。本标 准RT-LAMP，根 据 PRRSV 开放阅 读框 架 7（ORF7）基因序 列、ORF1a（非结 构蛋 白 Nsp2）基因 序列 设计 4 组 引物，建 立 4 种 RT-LAMP 检 测方 法（即 LAMP1、LAMP2、LAMP3 和 LAMP4)，其中 LAMP1的特异 性引 物识 别 ORF7 基因，LAMP2、LAMP3 和 LAMP4 的特 异性 引物 识 别 Nsp2 基 因。每 种 LAMP引物均 包括 两对 内、外引 物（内 引 物 FIP 与 BIP，外引 物 F3 与 B3）和一 对 环引物（LF 与 LB）。利用Bst 酶启 动循 环链 置换 反应，启动 互补 链合 成，通过 在同一 链上 互补 序列 周而 复始形 成有 很多 环状 结 构的茎 环 DNA 混合 物，在 恒 温条件 下完 成核 酸扩 增反 应。从 dNTP 析出 的焦 磷 酸根离 子与 反应 溶液 中的Mg2+结合，产 生副 产物（焦磷酸 镁）形成 白色 沉淀，加入 显色 液，即可 通过 颜色变 化观 察判 定结 果。该检测 方法 简便 快速、敏 感特异，不 需要 昂贵 的仪 器设备。DB32/T 37752020 2 5 试剂和 仪器 设备 5.1 试剂要 求 除有特 殊说 明外，所 有生 化试剂 均为 分析 纯。RNA 提取相 关试 剂或 用品 均 需 经无RNA 酶处 理。5.2 引物 PRRSV LAMP 检 测引 物和PRRSV 毒 株基 因亚 型鉴 别LAMP 引 物，人工 合成（基 因序列 见附录B.1）。5.3 通用试 剂 裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01 mol/L 磷酸盐缓 冲液（PBS，pH7.2）（见附 录A.1）；DEPC 处理 水（见附录A.2）；异丙 醇；75%乙 醇；耐 热M-MLV（RNase H-）反转 录酶；pMD18-T 载体；胶回 收试 剂盒（Qiagen）；质粒DNA 提取 试剂 盒（TaKaRa）；PCR 试剂（Promega）。5.4 LAMP 试剂 10 Bst DNA 聚合 酶 缓冲液（见 附 录 A.3）；100 mmol/L MgSO4；10 mmol/L dNTPs（dATP,dCTP,dTTP,dGTP)；8 U/L Bst DNA 聚合 酶；5 mol/L 甜菜碱（Betaine）；灭 菌双 蒸水。SYBR Green I 染料，1000。5.5 阴性及 阳性 对照 5.5.1 阴性对 照 pMD18-T 空载 体质 粒。5.5.2 阳性对 照 LAMP1 阳性对 照为pMD-BB-N 质粒（含 高致病性PRRSV BB0907毒株ORF7 基 因）；LAMP2 阳性对照为pMD-S1-Nsp2 质 粒（含 传统型PRRSV S1 毒株Nsp2 基因）；LAMP3 阳性 对照 为pMD-BB-Nsp2 质粒（含高致病 性PRRSV BB0907 毒株Nsp2 基因）；LAMP4 阳 性对照 为pMD-FJ-Nsp2 质 粒（含类NADC30 PRRSV FJ1402 毒株Nsp2 基因）。5.6 仪器 高速冷 冻离 心机，恒温 水 浴锅，微量移 液器（0.5 L 10 L、20 L 200 L、100 L 1 000 L），PCR 仪，EP 反 应管（0.5 mL、1.5 mL），组织匀浆 器或研 钵。6 检测程 序 6.1 样品处 理 按照NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾脏取约1g，剪 碎后 按1:3（V/V）加入PBS（0.01mol/L，pH7.2），充 分匀 浆呈 悬 液。血清 制备 方法 为：血DB32/T 37752020 3 液（不 加抗 凝剂）室 温静 置2 h 3 h 后，4000 r/min 离心5 min，取上 清液 置于EP 管 内。处理 好的 匀浆 悬液和血 清于-20 保存 备用。样品 RNA 制备 按照 经验 证 的 RNA 提 取方 法或 等效 的 商品 化 RNA 提 取试 剂盒，按照其 使用 说明 操作。提 取 的 RNA 应在 2 h 内进行 反转 录或 放置 于-20 保存 备用。6.2 反转录（cDNA 的 合成）配制反 转录 反应 体 系 19 L，含 M-MLV 5 Reaction buffer（含 Mg2+）4 L；2.5 mol/L dNTPs 1 L；Olige（dT）1 L，RNA 酶 抑制剂 0.5 L；DEPC ddH2O 5.5L,RNA 7 L，70水浴 5 min 后置冰上 冷却至 37，再加 入 1.0 L 反转录酶 M-MLV，42 水浴 1h 得 cDNA，用 于 下面 LAMP 扩增，或-20冻存备 用。6.3 LAMP 检 测方 法 6.3.1 反应体 系 采用四 管两 步RT-LAMP 检 测方法 进行。第一步（1 管）：采用LAMP1 通 用引 物（见附 录B.1），检测 所有PRRSV 毒株。第二步（3管）：对 第一 步检 测结果 为阳 性的 样本，采 用LAMP2、LAMP3 和LAMP4 引物（见附 录B.1），用3个EP 管，同时 进行LAMP，鉴别不 同基 因亚 型PRRSV。四个反 应管 反应 体系 相同，总体 积25 L，具体反 应 体系如 下：但其中 的引 物不 同，分 别 是LAMP1、LAMP2、LAMP3 和LAMP4 引物（见附 录B.1）。每次 检测 应分别 设 立 阴 性 和 阳 性 对 照 样 品 管。LAMP1 阳 性 对 照 为pMD-BB-N，LAMP2 阳 性 对 照 为pMD-S1-Nsp2，LAMP3 阳性 对照 为pMD-BB-Nsp2，LAMP4 阳性 对照 为pMD-FJ-Nsp2 质粒DNA，阴性 对照 为pMD18-T 空载体质 粒DNA。在 EP 管 的管 盖上 滴加 1000 SYBR Green 染料 1.0 L，再轻轻地 把盖 子盖 紧。6.3.2 反应条 件 将反应 管混 匀，置 64 1 扩增 40 min 且保证 管盖 上 的 SYBR Green I 不进入反 应物。10 Bst DNA 聚合酶缓冲液（见附录 A.3）MgSO4（4mol/L）2.5mM dNTPs 甜菜碱（Betaine）外引物 F3/B3（4mol/L）内引物 FIP/BIP（40mol/L）环引物 LF/LB（10mol/L）Bst DNA 聚合酶(8U)耐热 M-MLV 反转录酶 cDNA 模板 双蒸水 2.5 L 1.5 L 3.5 L 2.0L 各 1.0 L 各 1.0 L 各 1.0 L 1.0 L 1.0 L 1.5 L 6.0L 总计 25 L DB32/T 37752020 4 7 结果判 定 7.1 PRRSV 阴 阳性 判定 反应结 束后，将LAMP1 反 应管12 000 r/min，离心1 min，轻轻混匀，观 察颜 色 变化，绿色 为阳 性，淡黄色 为阴 性。7.2 PRRSV 基 因亚 型的 类型 判 定 在阴性 对照、阳 性对 照符 合时，判定 样品 检测 结果（参见 附 录 B.2）。若 LAMP1 结 果为 阳性，则判定 是 PRRSV 阳性，否 则判定 为 PRRSV 阴 性。若 LAMP2 检 测为 阳性，LAMP3、LAMP4 检测 为阴 性，则 判定 是 PRRSV 经 典 型毒株。若 LAMP3 检 测为 阳性，LAMP2、LAMP4 检测 为阴 性，则 判定 是 PRRSV 高致病 性毒 株。若 LAMP4 检 测为 阳性，LAMP2、LAMP3 检测 为阴 性，则 判定 是 PRRSV 类 NADC30 型 毒株。8 安全和 防污 染措 施 8.1 检测废 弃物 等实 验室 安全 防护 按 GB 19489 和 SN/T 1193 的规 定执 行。8.2 检测过 程中 防止 污染 措施 按 GB/T 27401 的 规定 执行。8.3 实验前 后，实验 室用 紫外 线消毒。DB32/T 37752020 5 A A 附录 A（规范 性附 录）试剂配 制 A.1 0.01 mol/L（pH7.2）的磷 酸盐 缓冲 液（PBS）A 液（0.2 mol/L 磷 酸二 氢 钠水溶 液）：NaH2PO4 2H2O 27.6 g，先 用适 量蒸馏 水 溶解，最后 用蒸 馏水稀释 至 1000 mL。B 液（0.2 mol/L 磷 酸氢 二 钠水溶 液）：Na2HPO4 12H2O 71.6 g（或 Na2HPO4 2H2O 35.6 g）先 用适 量蒸馏水溶 解，最后 用蒸 馏水 稀释 至 1000 mL。A 液 14 mL，B 液 36 mL，加氯化 钠（NaCl）8.5 g，最后用 蒸馏 水定 容 至 1 000 mL；121，15 min高压灭 菌，4 保 存备 用。A.2 DEPC 处理 水 用 0.1%DEPC 处 理后 的蒸馏 水（DEPC 与蒸 馏水 1:1000 混 合），经 121 15 min 高压 处理，用 于溶解 RNA。A.3 10 Bst DNA 聚合 酶 缓冲液 含 200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L(NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4，1%Triton-100，pH8.8，25 保存。DB32/T 37752020 6 B B 附 录 B（资料 性附 录）引物序 列 B1 PRRSV LAMP 检 测引 物 和 PRRSV 毒 株基 因亚 型鉴 别 LAMP 引 物序 列，见表B.1。表 B.1 LAMP 引 物序 列 引物种类 引物名称 序列 bp 通用引物 LAMP1 G-F3 AGAAAAACCCGGAGAAGCC 140-156 G-B3 TGCTGAGGGTGATGCTGT 352-369 G-FIP ACAATTGCCGCTCACTAGGGGTTTTCCATTTCCCTCTTGCGACT 157-177 203-223 G-BIP CGCTGGAACTTGTGCCCTGTTTTTGCACAGTATGTTGCGTAGGC 258-277 318-337 G-LF GTGATGCCTGACGTCATCTTC 178-198 G-LB GGGAGGATAAGTTACACTGTGGA 286-308 BB-N F ATGCCAATAATAACGGCAAGCA 0-22 R TCATGCTGAGGGTGATGCTGT 351-371 经典毒株 LAMP2 C-F3 ACCGCAATGCATCTTCAGG 1523-1546 C-B3 GTCTGTGAGGAAGCAGACAA 1723-1743 C-FIP TCGGCTCACTCAAGGGTGTCATTTTAGTGAGCCGGCTCCAATT 1561-1578 1611-1619 C-BIP GCACCGCGGCGTAAGTTTCATTTTGTTCTGGTACGGTGGGATTG 1642-1662 1692-1711 C-LB GCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGC 1664-1686 S1-Nsp2 F AGCTGGTGATTGTGTCCTCA 1500-1520 R CTCTACTCCCAGAACGCCCCC 1780-1800 高致病性毒株 LAMP3 H-F3 TTGAGGCGGCGAATCAGA 887-905 H-B3 CCAGGACAACCTCTTCCAAC 1077-1096 H-FIP CCTTGCCCAAAGGCTCTTGAGTTTTTAACCGGACAACCTCACGT 906-923 955-976 H-BIP TGACCGCCTTCTCACTGTCCATTTTCCTCTCACGGTGATGAACCT 988-1008 1037-1054 H-LF CAGGGTGCAGCATGAGTTG 925-943 H-LB TGCTATTACCCTGCACAAGGTG 1012-1033 BB-Nsp2 F TTGAGGAATGCTTGGCCAA 800-818 R TCGACCTGCTCAGCCGCCCGGGCCA 1126-1250 类 NADC30毒株 LAMP4 N-F3 TTGTGCTTCCTGGGGTTG 871-891 N-B3 AACTACCACACCTGGACCT 1384-1399 N-FIP GCCATGACAGAAACTGGAGCGTTTTTGAGGCTGCTCAAGCAACG 893-910 934-957 N-BIP AAGCGGAGTCTGTCAGGAGCCTTTTGATCTTTCTGCGTGGGGC 1321-1343 1365-1384 N-LF TGGTTGATAGGGGGCAGTTC 912-927 N-LB TCCAGAGAGCAGGCCTCT 1343-1363 FJ-Nsp2 F TGAAGAATGCTTGGCTAGGCT 800-820 R CTACGCTTGACAGGGAGCT 1481-1500 DB32/T 37752020 7 B.2 RT-LAMP 结 果示 图 RT-LAMP 检测 结果 示图B.1 图B.1 RT-LAMP 检测 方法 染料染 色图 1.阳性样 品（+）2.阳性对 照（+）3.阴性对 照（-）_ _
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