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ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3257 2020 猪繁殖与 呼吸综合 征病毒抗 体 酶联免疫 检测方法 Method of ELISA for PRRSV antibody NEQ 2020-04-30 发布 2020-05-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/T 3257 2020 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 缩 略语.1 4 原理.1 5 仪 器和 器材.1 6 试剂.2 7 操 作步 骤.2 8 试 验成 立条 件与 结果 判 定.3 9 检 测过 程中 防止 交叉 污 染的措 施.3 10 废 弃物 处理.3 附录 A（资 料性 附录）试剂配 制.4 DB21/T 3257 2020 II 前 言 本标准 按 照GB/T 1.1 2009 给 出的 规则 起草。本 标准 由动 物卫 生标 准化技 术委 员会（辽 宁）提出，辽宁 省农 业农 村厅 归口管 理。本标准 起草 单位：辽 宁省 农业发 展服 务中 心。本标准 协助 单位：洛 阳现 代生 物 技术 研究 院有 限公 司、辽 宁佰 瑞生 物科 技有 限公司。本标准 主要 起草 人：周晨 阳、魏 澍、高志 峰、魏园 园、王 冰、董娜、刘 金玲、刘耀 川、杨作 丰、高原、王 连山、马 亮亮、潘 婷婷、杨嵘 长、姜斌、杨 太东、于春 玲。本标准 发布 实施 后，任何 单 位和个 人如 有问 题和 意见 建议，均可 以通 过来 电和 来 函等方 式进 行反 馈，我们将 及时 答复 并认 真处 理，根 据实 际情 况依 法进 行评估 及复 审。归口管 理部 门通 讯地 址：辽 宁省农 业农 村厅（沈 阳市 和 平区太 原北 街2 号），联 系电 话：024-23447862；标准起 草单位 通讯 地址：辽宁省 动物及 产品 检疫中 心（沈 阳市沈 河区 万柳塘 路105号 甲），联 系 电话：024-24229579。DB21/T 3257 2020 1 猪 繁殖与 呼吸综合 征病毒 抗体酶联 免疫检 测方法 1 范围 本标准 规定 了猪 繁殖 与呼 吸综合 征 病 毒抗 体酶 联免 疫检测 方法 的技 术要 求。本标准 适用 于在生物安全 级（BSL-2）以 上 的 实 验 室 进 行 猪繁殖与 呼吸 综 合征病 毒病 的诊 断、监测及 流行 病学 调查，适 用于猪 血清 或血 浆样 品中 的猪 繁 殖与 呼吸 综合 征 病 毒抗体 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB 19489 实验室 生物 安全通 用要 求 GB/T 19495.2-2004 转基 因产品 检测 实 验室 技术 要 求 3 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 标准。ELISA：酶 联免 疫吸 附测 定（enzyme linked immunosorbent assay）PRRSV：猪 繁殖 与呼 吸综 合 征 病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus）PBS：磷酸 盐缓 冲液（phosphate buffer solution）OD：光 密度，表 示被 检测 物吸收 掉的 光密 度（optical density）4 原理 本方 法原理是包被 板上包被的 猪 繁殖与呼吸 综合征病毒（PRRSV）抗原，可与待 测样品中的特 异性抗体反应，形成抗原-抗 体复合物，再加入酶标记 的二抗，则形成免疫复合 物，洗涤后，如待测样品中含有PRRSV 抗体，显 色 深，为 阳性，反 之为 阴性。5 仪器和 器材 5.1 微 量可 调移 液器：50 L 200 L。5.2 5mL 采血针管 5.3 冰 箱：4 1 冰箱，-20 1 冰 箱。5.4 酶 标仪 5.5 37 恒温 培养 箱 5.6 高 速台 式离 心机（离 心范 围 020 000r/min）5.7 洗 板机 5.8 离 心管：4 mL 离心管、2 mL 离心管 和 1.5 mL 离心管。DB21/T 3257 2020 2 6 试剂 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使 用的试剂等级均为分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。6.1 猪 繁殖 与呼 吸综 合征 病毒抗 原包 被板。6.2 阳 性对 照：猪 繁 殖与 呼吸综 合征 病毒 抗体 阳性 猪 血清。6.3 阴 性对 照：无猪 繁殖 与呼吸 综合 征 病 毒抗 体猪 血清。6.4 酶 标复 合物：过 氧化 物 酶标 记的 抗猪 繁殖 与呼 吸综合 征病 毒单 克隆 抗体。6.5 PBS：磷 酸盐 缓冲 液（0.01 mol/L pH 7.4）配 制 见第 A.1 章。6.6 洗 涤液：配 制见 第 A.2 章。6.7 样 品稀 释液：配 制见 第 A.3 章。6.8 底 物溶 液：配制 见 第 A.5 章。6.9 终 止液：配 制见 第 A.6 章。7 操作步 骤 注：试验 操作 过程 中涉 及 生物安 全的 注意 事项 依据GB 19489 实 验室 生 物安全 通用 要求 的规定执行。7.1 样品的 采集、前 处理 与存 放 7.1.1 采样 注意 事项 采集样 品及 样品 前处 理过 程中应 戴一 次性 手套，样 本间不 得交 叉污 染。7.1.2 采样 工具 5 mL 采血针管和4 mL、2 mL 和1.5 mL 离心管经121 1 高 压灭 菌20 min。7.1.3 样品 的 采 集与 前处 理 采集血 液，用离 心机 分离 上清血 清，血清 应新 鲜、透明、不溶 血、无 污染。试验前 将被 检血 清统 一编号，并用 样品 稀释 液 作 40 倍 稀释。7.1.4 存放 前处理 后的 样品 密封 装于 灭菌 离 心管 内，4 或-20 保 存或 立即 检验。7.2 ELISA 检测 7.2.1 在使 用前，所 有的 试剂盒 组份 应恢 复 到 18 26。试 剂应 轻轻 旋转 或 振荡混 匀。7.2.2 取出 包被 板，加 入 100 L 没有稀 释的 阴性 对 照和阳 性对 照，每次 检测 各加两 孔；在相 应的 孔中加入 100 L 已经稀 释好 的 样品。7.2.3 在 37 条件 下温 育 30 min（1 min）。7.2.4 将各 孔的 液体 弃入 废液 桶，用 300 L 洗涤液 洗涤板 孔，共洗 涤 5 次。每次洗 涤后 应弃 去孔 内的液体。在最 后一 次洗 涤液 弃去后，将 孔中 残留 的洗 涤液在 吸水 纸上 拍干。7.2.5 每孔 加 入 100 L 酶结合物。7.2.6 在 37 条件 下温 育 20 min（1 min）。7.2.7 重复 步 骤 7.2.4。7.2.8 每孔 加 入 50 L 显色液 A 和 50 L 显色 液 B（也可 显色 液 A、B 等比 例混匀 后 加 100 L）。DB21/T 3257 2020 3 7.2.9 在 37 条件 下温 育 10 min（1 min）。7.2.10 每孔 加入 50 L 终止液，终止 反应。测 量并 且记录 样品 和对 照 的 OD 值（450 nm），15 min内读值 有效。8 试验成 立条 件与 结果 判定 8.1 试验成 立条 件 阴性对 照平 均值（NCX）NCX=(NC1+NC2)/2 阳性对 照平 均值（PCX）PCX=(PC1+PC2)/2 试验成 立判 断标 准：PCX-NCX0.5；NCX0.3。如果试 验无 效，试验 中的 操作值 得怀 疑，应按 照操 作说明 书重 做一 次试 验。8.2 结果判 定 样品的 计算 S/P=(样品 NCX)/(PCXNCX)如果样 品 S/P 值0.2，样 品应判 定为 抗体 阴性。如果样 品 S/P 值0.2，样 品应判 定为 抗体 阳性。9 检测过 程中 防止 交叉 污染 的措施 按照GB/T 19495.2-2004 的规定 执行。10 废弃物 处理 按照 农业 部关 于印 发 病死及 病害 动物 无害 化处 理技术 规范 的 通知（农医发 2017 25号)规定执 行。DB21/T 3257 2020 4 附 录 A（资料 性附 录）试剂配 制 A.1 磷酸 盐缓 冲液（PBS，0.01 mol/L pH 7.4）氯化钠 8 g 氯化钾 0.2 g 磷酸二 氢钾 0.2 g 十二水 磷酸 氢二 钠 2.83 g 蒸馏水 加至1 000 mL A.2 洗涤 液 PBS 1 000 mL 吐温-20 0.5 mL A.3 样品 稀释 液 含 体积 分数 为10%新 生 猪血清 的洗 涤液 A.4 磷酸 盐-柠檬酸 缓冲 液（pH 5.0）柠檬酸 3.26 g 十二水 磷酸 氢二 钠 12.9 g 蒸馏水 700 mL A.5 底物 溶液 用二甲 基亚 砜 3 3 55-四 甲基 联苯 胺（TMB）配成1%质量 浓度，4 保 存。使 用时 按下 列 配 方配制底 物溶 液。磷酸盐-柠 檬酸 缓冲 液 9.9 mL 1%33 5 5-四 甲基 联 苯胺 0.1 mL 30%双 氧水 1 L A.6 终止 液 浓硫酸 0.31 mL 蒸馏水 100 mL _
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