草菇菌种保藏技术规范DB45／T 1760-2018.pdf

ICS 65.0 20.99 B 39 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 17602018 草菇菌种保藏技术规范 Technical specification for preserving Volvari ella volvacea culture 2018-05-10 发布 2018-06-10 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发布 DB 45/T 1 76 0 20 18 I 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区农业科学院提出。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院微生物研究所。本标准主要起草人：吴圣进、韦仕岩、王灿琴、陈雪凤、吴小建、陈丽新、陈振妮、黄卓忠。DB 45/T 1 76 0 20 18 1 草菇菌种保藏技术规范 1 范围 本标准规定了草菇（Vo l va ri el la v o lv ac ea）菌 种保藏的术语和定义、原则、要求和保藏方法。本标准适用于草菇菌种中母种的保存。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 1 27 28 食用菌术语 GB/T 2 35 99 草菇菌种 3 术语和定义 GB/T 1 27 28 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 菌种 c ul tur e 可培养的具有保藏价值的菌丝纯培养物。3.2 母种 s to ck cult u r e 生长于试管斜面培养基上的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。3.3 菌种保藏 cult u r e pr ese rv at io n 将菌种用适宜方法妥善保藏，避免死亡、污染、退化，保持其原有性状稳定。3.4 厚垣孢子 c hla my do sp or e 草菇菌丝在生长过程中，菌丝细胞原生质浓缩、细胞壁增厚并断裂而形成的一种红褐色或棕褐色无 性孢子。4 原则 4.1 应根据菌种的使用频率选择适宜方法进行保藏。4.2 应使保藏的菌种不染杂菌。DB 45/T 1 76 0 20 18 2 5 要求 5.1 菌种保藏所使用的器皿应清洁、透明、无破损、无裂痕。5.2 接种时应对菌株编号及培养基分别进行核对，采用适宜的培养基和无菌操作。5.3 菌种培养至有厚垣孢子产生后进行保藏。5.4 菌种移植培养后，应与原保藏菌株的培养特性及其登记卡（包含菌株名称、编号、所用培养基、菌种代数等信息）逐个对照，检查无误后再存放。5.5 保藏期间应定期检查菌种存放 设施 的 温度、湿度，菌株有无污染、棉塞 有无 霉变、培养基是 否干 枯，如发现异常 应 重 新移植、培养、更换。5.6 传 代过程中，将保藏菌种在 营 养 贫乏 和 丰富 的新 鲜 培养基中作 交替 培养。5.7 菌种的 传 代移植 次 数不宜 超 过 4次。6 保藏方法 6.1 定期移植保藏法 按 附录A 的规 定。6.2 液体石蜡保藏法 按 附录 B的规 定。6.3 液氮超低温保藏法 按 附录C 的规 定。DB 45/T 1 76 0 20 18 3 A A 附 录 A（规范性附录）定期移植保藏法 A.1 原理 亦称传代培养保藏法，是将菌种接种于适宜的斜面培养基中，最适条件下培养后，置于15 20 进行保存并间隔一定时间进行移植培养的方法。A.2 要求 A.2.1 宜在接种培养后用硅胶塞封存。A.2.2 使用前检查确认菌株是否变异，移植传代次数不宜超过4次。A.3 方法 A.3.1 培养基制备 A.3.1.1 配方 A.3.1.1.1 P DA培养基 去皮马铃薯20 0 g，葡萄糖 20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 0 00 mL。A.3.1.1.2 加富P DA培养基 去皮马铃薯20 0 g，葡萄糖20 g，酵 母 膏 2 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g,琼脂20 g，蒸馏水 1 00 0 mL。A.3.1.2 配制 将 马铃薯切 成 边 长 0.5 c m 1.0 c m 的方形小 粒，加入蒸馏水 1 00 0 mL，置 小 铝锅 或不 锈钢锅煮沸 20 min 30 m in，用 4层纱 布过 滤，取 马铃薯滤液，加入琼脂 继 续加热，边加热边搅 拌，直到琼 脂完全液化，加入葡萄糖等其他成分，调节pH为 8.0，补水至 1 00 0 mL，搅拌均 匀。A.3.1.3 分装 将配制好的培养基分装至直径18 mm、长18 0 mm 的玻璃试管中，装量为每管 8 mL 15 mL。试管口 应 保持干净，随后塞入棉塞或硅胶塞，并用牛皮纸包扎。A.3.1.4 灭菌 将 配制分 装 和包扎好的试管 直立放在 高压蒸汽 灭菌 锅内加 热灭菌。加热到 0.0 5 MPa 时，打开 排 气阀排气，待压力指针回到零点后，关闭排气阀。重复操作两次后继续加热，当压力升到0.11 MP a（温度12 1）时，持 续加热 30 mi n 后停止加 热，待指针回到零点，立即取出试管，并倾斜摆放在桌面上，试 管口比试管底部高 1.0 c m1.5 cm，做成培养基斜面，培养基长度不超过试管长度的1/2。DB 45/T 1 76 0 20 18 4 A.3.1.5 灭菌效果检查 将 灭 菌后的试管斜面培养基 置 于（3 0 2）条 件下1 d 2 d 后检查是 否 有细菌或 霉 菌的菌 斑。A.3.2 接种 用接种 铲挖取 长有草菇菌丝体的长0.5 c m、宽 0.5 c m 的 琼脂 培 养基，转 移 到 新 鲜 斜面上，接种 位 置 为 培养基斜面中间，且 菌丝面 朝 上。接种后 立即塞 上 棉塞 或 硅胶塞，用 牛皮纸 包 扎 试管 口，贴 上标 签。A.3.3 培养 将接种后的试管 置 于30 32 温 度 下培养7 d 10 d，当 菌丝 长 满 斜面并有少 量 红褐色厚垣孢子 产生时结 束 培养。A.3.4 性状指标 菌丝应 呈灰白 至黄 白 色，浓 密粗 壮，萌发 生长 快，分 布均匀，气 生菌丝 旺盛，爬 壁 力强，菌丝分 枝 角度大，能 产生 大量 红褐色厚垣孢子。A.3.5 保藏 培养 好 的菌种于 温度 1 6 18、相 对 湿度 50%70%环境 下 保藏。也 可以将培养 好 的菌种 齐 试管口 将 棉塞 或 胶塞剪 下，用 干净 的 固 体 石蜡加热熔 化后 封口 再保藏。A.3.6 定期移植 草菇菌种保 藏时间不宜 超 过9 0 d，参 照G B/T 2 3 5 9 9的要求，每隔 3个 月 将保 藏的菌种 转 接 到 新 鲜 培 养基中，适宜 条 件下培养后再保藏。用 固 体 石蜡封口 的草菇菌种可保藏1 年。DB 45/T 1 76 0 20 18 5 B B 附 录 B（规范性附录）液体石蜡保藏法 B.1 原理 菌种在适宜的斜面培养基上培养好后，注入灭菌的液体石蜡，在 液体石蜡完全覆盖下进行保存的方 法。B.2 要求 B.2.1 应选用化学纯液体石蜡。B.2.2 操作时应防止液体石蜡燃烧。B.2.3 应使用电子式火焰灭菌器对移种过培养物的接种铲灭菌。B.2.4 保藏场所应保持干燥，防止胶塞污染。B.2.5 保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌液体石蜡。B.3 方法 B.3.1 液体石蜡准备 将液体石蜡分装，塞上胶塞，用 牛皮纸包好，在12 1 下灭 菌30 mi n后置 于40 恒温 箱中，待水 分 完全蒸发，经无菌检查后备用。B.3.2 培养物制备 符合附录A.3.1的规定。B.3.3 石蜡灌注 无菌条件下将经灭菌的液体石蜡注入培养物上，液面高出培养物斜面1 cm2 cm，加胶 塞 并用 固 体 石蜡封口。B.3.4 保藏 将草菇菌种直立存放于1 5 20 的干燥处。保藏时间1年。保藏期间应定期检查菌种活力及杂菌 情况，液体石蜡减少，露出培养基斜面时应及时补充经灭菌的液体石蜡。B.3.5 恢复培养 挑取小块菌种块转接在适宜的新鲜培养基上，置于30 下 培养。生长繁殖后，再重新转接一次。DB 45/T 1 76 0 20 18 6 C C 附 录 C（规范性附录）液氮超低温保藏法 C.1 原理 将菌种 先置 于含有 冷冻 保 护剂 的 容 器 内，再保存于-15 0 气相液氮 或-19 6 的 液相液氮 中的保藏 方法。C.2 要求 C.2.1 操作时应 戴 上面具和 皮手套，冻 存管应 拧紧螺帽。C.2.2 运送液氮 应使用 专 用特 制液氮罐，存放 液氮罐 的 房 间应保持 良好通风。C.2.3 应 防止 安瓿 管 爆 裂。C.2.4 注 意 液氮罐 中 液氮 的 残 存 量，定期 填 充液氮。C.3 方法 C.3.1 准备 C.3.1.1 安瓿管或冻存管 选用 耐 温度 骤 变，耐 压，管壁 厚 度均 一 且为 中性 玻璃 的 安瓿 管，或 螺 旋 口 的 塑料 冻 存管。注 意 玻璃 管不 得 有裂 纹。清 洗安瓿 管时，先 用2%盐 酸 浸泡 8 h 12 h，然 后用自 来 水 冲洗 3 次 以上，宜用 蒸馏水 冲 洗，浸泡 至 pH 中性，然 后 干燥。塑料 冻 存管用 蒸馏水 浸泡 8 h 12 h，冲洗 干净，干燥即 可。在1 2 1 下 高压灭 菌1 5 m i n 20 m i n，安瓿 管 也 可在1 6 0 烘 箱 中 干热灭 菌2 h，备 用。C.3.1.2 标签 使用 专 用的 非 水 溶 性记号 笔 作标记，记 录 菌种编号和保藏日期。C.3.1.3 保护剂 宜采用无菌的10%20%甘油 作 为 保 护剂。加 甘油 于 蒸馏水，配制 浓 度为 10%（体 积 分数）或20%（质 量 分数）的 甘油，然 后1 21 高压灭 菌15 m i n 20 m i n。C.3.1.4 培养物 将草菇培养物接种于 装 有 P D A 培养基 的 平 皿中，于30 培养 7 d 10 d，形 成菌 落 并产生少 量 红褐色 厚垣孢子时结 束 培养。C.3.2 分装 用无菌 打 孔 器 从 草菇菌 落 边 缘 1 c m处 切取直径 5 mm 10 mm 的菌 种 块，放 入冻 存管 内 与保 护剂 混 匀，保 护剂 用 量 以不 超 过 冻 存管 高度 的2/3 为 宜。菌种 块 和保 护剂 应 置 于 冻 存管 底部，避 免 溅 污上 部 管壁。DB 45/T 1 76 0 20 18 7 分装完后立即封口。若用安瓿管保存时，在距离管口5 c m用酒精 喷灯将其熔封；如使用塑料冻存管保存，应立即拧紧螺帽。C.3.3 预冻 预冻时，温度宜控制在每分钟下降1，至-35-4 0。常 用降温方法有：程序控温降温法：应用程序控制降温仪，稳定连续降温，控制好降温速率；冷冻干燥机自行冷冻：在 不 开启真空泵的情况下，利用冷冻干燥机的制冷作用，将菌种冷冻至-35-40；将菌种放置于-80 冰箱 预冻。温度控制在每分钟下降 1，至-35-4 0。C.3.4 冷冻保藏 将预冻好的 安瓿管或冻 存管置于液氮罐中保藏。气相温度为-15 0，液相温度为-19 6。保藏周 期5年10 年。C.3.5 复苏 从液氮罐中取出菌种冻存管，立即置于37 4 0 水浴中轻轻摇动，直到融化为止。无菌条 件下开启冻存管，将菌种块移接到加富P DA培养基，于30 下培 养。生长繁殖后，再重新转接一次。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 草菇菌种保藏技术规范 DB45/T 1760 2018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究