玉米转基因成分检测操作技术规程DB21／T 3241—2020.pdf

1 ICS 65.020.20 B 05 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 3241 2020 玉米转基 因 成分检 测操作技 术规 程 Technical specification for detection of genetically modified components in Maize 2020-03-30 发布 2020-04-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/T 3241 2020 1 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 编写。本标准 由辽 宁省 农业 农村 厅 提出 并归 口。本标准 起草 单位：辽 宁省 农业科 学院。本标准 起草 人：李会、王 建忠、王颖、任 志莹、陈 芳芳、王在 亮。本标准 发布 实施 后，任何 单 位和个 人如 有问 题和 意见 建议，均可 以通 过来 电和 来 函等方 式进 行反 馈，我们将 及时 答复 并认 真处 理，根 据实 际情 况依 法进 行评估 及复 审。归口管 理部 门通 讯地 址：辽 宁省农 业农 村厅（沈阳 市和 平区太 原北 街2 号），联系 电话：024-23447862 标准起 草单 位通 讯地 址：辽宁省 农业 科学 院（沈 阳 市沈河 区 东 陵路84号），联 系电话：024-31021049 DB21/T 3241 2020 2 玉米 转基 因 成分检 测操作 技术规 程 1 范围 本标准 规定 了玉 米 转 基因 成分检 测过 程中 抽样、样 品接收、样 品处 理、关键 试剂验 证、检测、结果判定与 复验、检 测后 样品 的保存 及 处 置、废弃 物处 理等内 容。本标准 适用 于PCR 方法 和 试纸条 方法 检测 玉米 及其 产品转 基因 成分 的操作 规程。2 规范 性引 用文 件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 19495.8 转基 因 产品检 测 蛋 白质 检测 方 法 SN/T 4835 实 验室 生物废 弃物 管理 要求 农业部1485 号公 告-4-2010 转 基因 植物 及其 产品 成 分检测 DNA 提 取和 纯化 农业部2031 号公 告-19-2013 转 基因 植物 及其 产品 成 分检测 抽样 农业部2259 号公 告-4-2015 转 基因 植物 及其 产品 成 分检测 定性PCR 方法 制定 指南 3 术语 与定 义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 阳性PCR 对照 positive PCR control 用含有 目的 序列 的样 品 DNA 进行 PCR 扩 增。3.2 阴性PCR 对照 negative PCR control 用不含 有目 的序 列的 样 品 DNA 进行 PCR 扩增。3.3 PCR 空白 对照 PCR blank,negative reagent control 以水或 不含 目 的 DNA 试剂 进行 PCR 反 应，以验 证 PCR 反应 过程 中未 被污 染。3.4 DB21/T 3241 2020 3 检测试 纸条 dip stick format 应用双 抗体 夹心 免疫 层析 的原理，试 纸条 包装 上明 确标注 了保 质期、稳 定性 试验证 明、生产 厂家、限量值 等内 容，适合 快速 定性分 析的 侧向 流动 试纸 条。3.5 抽样 sampling 采用适 合的 工具 按照 规定 的方法，从 市场 或田 间 随 机采集 样品 的活 动。3.6 送样 Sample sending 送检 单位 自行 抽取 和标 识，符 合转 基因 检测 样品 要求，自行 送到 转基 因检 测机构 委托 检测 的活 动。3.7 DNA提 取试 剂盒 DNA Extraction Kit 通过物 理和 化学 方法 使DNA 从样品 的不 同组 分中 分离 出来，利用 不同 的纯 化方 法获得 纯化DNA，商业化生产 的 一 组试 剂 或 耗材。4 抽样 4.1 总 体要 求 按照农业部 2031 号 公告-19-2013 的 规定 执行。4.2 种子 及其 加工 品 4.2.1 种 子及 其加 工品 抽 样时，按照 指定 区域 随机 购买产 品即 可，每份 样品 抽取量 不少 于2Kg。4.2.2 所 需物 品：抽样 工 作单、洁净 无污 染物 的样 品袋 等。4.2.3 抽样 工作单 根据 实 际情况，包含 以下 内容：样品名 称、样 品编 号、商 标、型 号规格、生 产日期或批号、抽样 数量、抽 样场 所、受检 单位 情况（受 检单 位名称、通讯 地址、法 定代 表人、联 系人、电 话）、生产单 位情况（单 位名称、通讯 地址、联系 人、电 话）、抽样单 位情 况（单 位名称、联系 人、电话、通讯地址）、受 检人 签字、受检单 位负责 人签 字、受 检单位（公章）、抽样人 签字、抽样单 位（公章）、抽样日 期、备 注。4.3 叶片 4.3.1 每 份样 品随 机抽 取20 个单 株的 叶片 混合，每片叶 片取 顶端 约 5cm 长 的叶尖。DB21/T 3241 2020 4 4.3.2 根据 实际需 要，所 需物品 如下：GPS 定位仪、采样 信息表、自 封袋、离心管、离心 管架、塑料滴管、小烧 杯、剪刀、称 量纸、试纸 条、玻璃 研磨 棒 等。4.3.3 采 样信 息表 根据 实 际情况 包含 以下 内容：单 位名称（公 章）、序 号、样品编 号、取样 地点（市、县、乡）、GPS 信息、试 纸条检 测参 数及 结果、抽 样日期、抽 样人 员、备注。5 样 品接 收 5.1 所送 样品 按照 样品 接 收 所规定 的 要求 执行。5.2 样品 接收 应登 记以 下 项目：样品 名称、样品 编 号、检 验类 型、样 品重 量、样品 状态、时间 要求、是否保留 副样、报告 领取方 式、提 供报告 要求、检测 依据、检测项 目、委托单 位、联 系电话、付 费总 额、付费方 式、委托 人、到样 日期、收样 人、备注。5.3 在检 出限 量为 0.1%的情况 下，要求 送 检玉 米 样品数 量应 达 到 3000 粒或重量达 到 1000g。如果 送 检玉 米 样 品 不 能 达 到 规 定 数 量 或 重 量，则 应 注 明 不 能 复 检。其 它 限 量 时 需 要 的 样 品 数 量 可 以 按 照 农 业 部2031 号公 告-19-2013 的规 定执行。5.4 样品 接收 时注 意包 装 是否完 好，如有 破损 应及 时更换 样品，对 纱网 袋包 装的样 品 装 入洁 净无 污染 的样品袋 后再 进行 编号。5.5 样品 由接 样 人 员接 收，登记，编 号后，交 由样 品 保管员 入库 管理。检 测人 员检测 时 填 写样 品领 取返还记录 表。6 样 品处 理 6.1 每份 样品 处理 要 使 用 独立的 研磨 杯，研磨 杯在 使用前 应先 刷洗，并 使用 次氯酸 钠溶 液或 者商 业化 的含有 DNA 酶 的试 剂浸泡 10 分钟，再用 清水 冲洗 干净，最后 用蒸 馏水 漂洗，晾 干备用。6.2 固体 样品 研磨 处理 成 颗粒状，直 径 在 2mm 以 下。6.3 样品 处理 的研 磨过 程 需 在负 压或 局部 负压 环境 下操作。6.4 每个 样品 研磨 后，使 用 次氯 酸钠 溶液 进行 环境 清洁，防 止交 叉污 染。注 意 通风 橱台 面和 研磨 机机 体等位置 的擦 拭，防止 样品 处理过 程中 交叉 污染。6.5 样品 研磨 后的 粉末 为 正样，用于 检测，剩 余的 样品为 副样，样 品应 粘贴 明确的 状态 标识，信 息包 括“待检、在 检和 检毕”。正样 和 副样 应妥 善保 管，用于复 验和 复检。DB21/T 3241 2020 5 6.6 称取0.1g 0.5g 研 磨好的 样品，或 遵照 所使 用 的 DNA 提取 方法 规定 的样 品量称 取样 品，用于 DNA的提取。7 关 键试 剂验 证 7.1 试剂 包括：DNA 提 取试剂 盒、引物、PCR 反 应体系 相关 试剂 和 试 纸条。7.2 每批 试剂 到货 后均 需 进行验 证，验证 可以 使用 已知的 转基 因 阳 性样 品，对 新购 试剂 进行 验证。8 检测 8.1 DNA 提取 8.1.1 DNA 提取 方法 可以 选用 农业部1485 号公 告-4-2010 中适 合的方 法进 行，也可 以选用 经过 验证 的商业化DNA 提取 试剂 盒 进 行 提取。8.1.2 样品DNA 的 提 取 纯 度OD260/OD280 值 应 在1.7 2.0 之 间，超 出 范 围 的 应 重 新 进 行 提 取。提 取 好 的DNA 按照 公式：加水 量（L）（DNA浓度ng/L25-1）吸取DNA量（L），稀 释至25ng/L，置于冰箱冷 藏箱 内备 用。8.2 样品 的试 纸条 检测 8.2.1 试 纸条 检测 可以 按照GB/T 19495.8 转基 因产品 检测 蛋 白质 检测 方 法中的 方法 进行。8.2.2 商 业化 的试 纸条 在 使用前 需用 已知 转基 因阳性 样品 进行 验证，合 格后 再使用。8.2.3 叶片 进行试 纸条 检 测时，可先将 叶片 剪成小 块，装 入 离心 管中，加入 适量纯 净水，使用 研磨棒研磨至 水呈 黄绿 色，即可 进行试 纸条 检测。8.3 引物 设计 与合成 8.3.1 需 要进 行引 物设 计 时，按 照 农 业部2259 号公 告-4-2015 转基 因植 物及 其 产品成 分检 测 定性PCR方法制 定指 南 的 规定 进行 设计和 验证。8.3.2 引 物需 按现 行有 效 的 标准 进行 合成。8.3.3 引物 一般采 用 外 协 的方式 进行 合 成，应保留 委托方 提供的 引物 合成的 质量记 录，即 在每 批引物使用前 进行 质量 合格 的验 证。8.4 PCR扩增 8.4.1 PCR 扩 增体 系的 配 制 和DNA 样 品加 入应 在不 同 的超净 工作 台或 生物 安全 柜内进 行。8.4.2 PCR 扩 增体 系中，应包括PCR 空白 对照、阴 性PCR 对 照、阳性PCR 对 照，且扩增 结果 必须 与预 期 结果 一致。8.4.3 玉米样 品的PCR 扩增 参数 包括：CaMV35S 启动 子、NOS 终止 子、bar 或 pat 基因 和 玉 米内 标准基因 等。8.5 琼脂 糖凝 胶电泳 8.5.1 根 据选 用参 数的 扩 增片段，选 择合 适的Marker，一般 选用 DL2000Marker。DB21/T 3241 2020 6 8.5.2 配制 的 琼脂 糖凝 胶 浓度为2%，即每100mL 电 泳液中 加入2g琼 脂糖。8.5.3 配制 琼 脂糖 凝胶 的 溶液须 与电泳 的 电极 缓冲 液一致，可 直接 购买50 TAE，稀释 至1 备 用。琼脂糖凝 胶板 应提 前制 作好，至少 冷却30min 以上才 能 使用。8.5.4 DNA 向电 泳的 正 极泳动，点 样孔 放置 于 负 极方向。8.5.5 电 源控 制在2 V/cm 5 V/cm,胶板 长度 在12 cm 左右时，电 压一 般在80V 110V，电 泳时 间为40min 60min。9 结 果判 定与 复验 9.1 筛 选因 子检测 结果 为 阴性的，即可 判定 为转基 因阴性 样品。筛选 因子检 测结果 出现一 个或 多个因子为阳 性的，需 要进 行复 验。9.2 复验 结果 与初检 结 果 一致时，即 可确 认为 阳性 结果，并 需 进一 步确 认 转 基因玉 米样 品 的 转化 体。9.3 复验 结果 与初 检 结 果 不一致 时，需 取 正样 进行 第三次 复验，结 果以 两次 相同结 果 为 准。9.4 根 据筛 选因子 的阳 性 结果，通过转 基因 玉米的 分子特 征，选 择相 对应的 转化体 进行确 认。常见转基因玉 米的 分子 特征 及对 应的转 基因 玉米 品种 见附 录A。10 检 测后 样品 的保 存及 处置 10.1 保存 10.1.1 样品 在 检毕 区 保 存。10.1.2 样 品保 存区 域应 具有 防 盗和 监控 设施。10.1.3 样 品检 测后 将阳 性样品 和阴 性样 品分 开保 存，阳 性样 品 保 存于 可以 上锁的 装置 中，钥匙 由 样 品保管员 保管，样 品 封 闭好 包装袋，避 免交 叉污 染。10.1.4 阴 性样 品保 存三 个月，阳性 样品 保存6个 月，以备 复检。10.1.5 种 子样 品 冰 箱冷 藏保存，叶 片样 品冰 箱冷 冻保存。10.2 处置 10.2.1 超 过保 留期 的样 品，在 丢弃 之前 应进 行详 细的记 录，内容 包括：中 心编号，样 品名 称，样 品 状态，样 品重 量，样品 处理 方法，样品 保管 人，申请 处理时 间，批准 人，备注 等项目。10.2.2 超 过保 留期 的阴 性玉米 样品，包 括正 样和 副 样，按照 实验 室样 品处 理程序 执行。10.2.3 超 过保 留期 的阳 性玉米 产品，正 样和 副样 经121 高 压灭 活，再 按照 实验室 样品 处理 程序 执 行。11 废 弃物 处理 11.1 实验 过程 中产 生的 废液主要为 DNA 提取 过程 中的废 液，需 由 有资 质的 回收企 业进 行回 收，统 一 处理。DB21/T 3241 2020 7 11.2 使用 过的 移液 器吸 头、PCR 扩增 后的 产物 应放 入次氯 酸钠 溶液 的容 器内 浸泡，浸泡 时间 不少 于24h，进行无 害化 处理 之后 按照SN/T 4835 实 验室生 物废 弃 物管理 要求 进行 处理。11.3 在进行琼脂糖凝胶电泳时，尽量避 免使用EB（溴化乙锭）进 行染色，如必需使用时，应将使用后 的电泳 液进行 活性炭 吸附 过滤，进行无 害化处 理之后 按照SN/T 4835 实验室 生物废 弃物管 理要求 进行处理。DB21/T 3241 2020 1 附录A（资料 性附 录）常 见转 基 因玉米 分子 特征 常见转 基因 玉米 分子 特征 信息见 表A.1.表 A.1 常 见转 基因 玉米 分子特 征 转化事件 转化方法 基因 1 基因 2 基因 3 启动子 外源基因 终止子 启动子 外源基因 终止子 启动子 外源基因 终止子 Bt11 基因枪 CaMV35S cry1Ab NOS CaMV35S pat NOS Bt176 基因枪 P-CDPK cry1Ab CaMV35S P-PPC cry1Ab CaMV35S CaMV35S Bar CaMV35S GA21 基因枪 PractI/RuBiSCo m-epsps NOS MON810 基因枪 CaMV35S cry1Ab MON863 基因枪 CaMV35S cry3Bb1 T-hsp CaMV35S nptII NOS NK603 基因枪 eCaMV35S Cp4-epsps NOS PractI/CTP2 Cp4-epsps NOS T25 化学介导 CaMV35S pat CaMV35S TC1507 基因枪 Ubi Zm1 cry1F ORF25polyA CaMV35S pat CaMV35S 59122 农杆菌 Ubi Zm1 cry34Ab1 PinII P-peroxidase cry35Ab1 pinII CaMV35S pat CaMV35S MON89034 农杆菌 eCaMV35S cry1A.105 Hsp17 FMV35S cry2Ab NOS CaMV35S NptII NOS MON88017 农杆菌 CaMV35S cry3Bb1 T-hsp P-ract1/CTP2 Cp4-epsps NOS MIR604 农杆菌 Pmi cry3A NOS Ubi Zm1 mpi NOS MIR162 农杆菌 ZmUbiInt vip3Aa19e CaMV35S ZmUbiInt pmi NOS DB21/T 3241 2020 2 转化事件 转化方法 基因 1 基因 2 基因 3 启动子 外源基因 终止子 启动子 外源基因 终止子 启动子 外源基因 终止子 3272 农杆菌 Gzein amy797E CaMV35S ZmUbi pmi NOS BVLA430101 基因枪 LEG phyA LEG MON87460 农杆菌 P-Ract1，CaMV35S CS-cspB，nptII T-tr7，NOS _