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ICS 65.020 B 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3893 2020 芋头病毒 检测技术 规程 Detection and identification of taro viruses 2020-03-31 发布 2020-05-01 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB 37/T 38932020 I 前 言 本标准 由山 东省 农业 农村 厅提出。本标准 由山 东省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：山 东省 农业科 学院 植物 保护 研究 所。本标准 主要 起草 人：姜珊 珊、辛 相启、吴 斌、张眉、王升 吉、辛志 梅。DB 37/T 38932020 1 芋 头病毒 检测技术 规程 1 范围 本标准 规定 了芋 花叶 病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）和黄 瓜花 叶病 毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的RT-PCR 的检 测 方法。本标准 适用 于芋 头叶 片中 芋花叶 病毒 和黄 瓜花 叶病 毒的检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 检测对 象 3.1 芋花叶 病毒 中文名：芋 花叶 病毒 学名：Dasheen mosaic virus 缩写：DsMV 分类地 位：马铃 薯Y病毒科（Potyviridae），马 铃薯Y病毒 属（Potyvirus）病毒粒 子、传 播途 径及 危 害：病毒 粒子 呈线 状，长 度约为750 nm。一般 通过 蚜虫传 播，还 可通过机械摩擦 传播。感 染DsMV 的 芋头植 株通 常表 现为 叶片 花叶、斑驳、皱 缩卷 曲、叶 脉黄化 和茎 坏死 等症 状。3.2 黄瓜花 叶病 毒。中文名：黄 瓜花 叶病 毒 学名：Cucumber mosaic virus 缩写：CMV 分类地 位：雀麦 花叶 病毒 科（Bromoviridae），黄 瓜 花叶病 毒属（Cucumovirus）病毒粒 子、传播 途径 及危 害：病 毒粒 子为 球状，直 径28 nm 30 nm。主要 由 蚜虫以 非持 久性 方 式传播。导致 寄主 出现 花叶、黄化、皱 缩等 症状。4 主要仪 器设 备、用具 和试 剂 4.1 仪器设 备和 用具 仪器设 备和 用具 主要 有：a)PCR 仪；b)电泳仪；c)水平电 泳槽；DB 37/T 38932020 2 d)凝胶成 像仪；e)高速冷 冻台 式离 心机；f)纯水仪；g)万分之 一天 平；h)普通冰 箱（0 4）；i)-20 低温冰 箱；j)-70 低温冰 箱；k)磁力搅 拌器；l)高压灭 菌锅；m)可调微 量移 液器（10 L、100 L、200 L、1000 L、5000 L）；n)RNase-free 吸头（10 L、200 L、1000 L）；o)RNase-free 离心管（1.5 mL、2.0 mL）；p)RNase-free PCR 反 应管。4.2 试剂 所有实 验用 试剂 均为 分析 纯；相 关试 剂配 制方 法详 见附录A；除特 殊 说 明外，均为符 合GB/T 6682，实验用 水为 无菌 超纯 水或 去离子 水。4.2.1 RNA 提取 试剂：a)多糖多 酚植 物 RNA 提取 试 剂盒或 其他 等效 产品；b)三氯甲 烷；c)异丙醇；d)75%乙 醇；e)RNase-free 超纯水。4.2.2 反转录 试剂：a)随机引 物；b)RNase 抑 制剂；c)逆转录 酶：AMV 或其 他等 效酶；d)dNTPs（10 mM）；e)-20 C 贮藏。4.2.3 PCR 试 剂：a)DNA 聚 合酶 试剂盒：2 Es Taq MasterMix 或其 他等 效产品；b)DNA 分 子量 标记物：100 bp 2000 bp；50 TAE 缓 冲 液；c)核酸染 料：Gelred（10000）溶液 或其 他等 效溶 液；d)含 10-4倍 浓度 Gelred 的 1%琼脂 糖凝 胶；e)6 DNA 上样 缓冲 液。5 RT-PCR 检 测方 法 5.1 方法提 要 DB 37/T 38932020 3 芋 花 叶 病 毒 和 黄 瓜 花 叶 病 毒 皆 为RNA 病 毒，利 用TransZol Plant 多 糖 多 酚 植 物RNA 提 取 试 剂 盒 进 行RNA 纯化，然 后进 行RT-PCR 检测，通 过琼 脂糖 凝胶 电泳对 检测 结果 进行 判定。5.2 样品采 集 观察芋 头叶 片是 否出 现叶 脉褪绿、脉 间褪 绿黄 化、叶片皱 缩、花叶、叶 片畸 形等典 型病 毒病 症 状，取出现 上述 症状 的样 品装 至无菌 样品 袋中，标记 样 品编号、取样 时间、取 样地 点，于低 温条 件下（2 8）运 送至 实验室，放置-70 超 低温 冰箱 保存 备用。样 品避 免反 复冻 融。以 通过分 子检 测不 含病 毒 的样品作 为阴 性对 照，以 确 定感染DsMV 或CMV 的样 品为阳 性对 照。以 下操 作 对阴性 对照、阳性 对照 进 行同样处 理。5.3 RNA 的提 取和 纯化 5.3.1 称取 100 mg 样品 置 2 ml 离心管 中，用液氮 速 冻后 迅 速 研磨，然 后加 入 1 mL 裂 解缓冲 溶液（1 mL/100 mg 样品），剧 烈振 荡 混匀，室温 放 置 5 min；4，13000 rpm 离心 5 min。5.3.2 取上清 液 于 1.5 mL 离心 管中，加 等体 积的 缓冲 液 2，颠倒 混匀 后加 入 1/4 体 积三氯 甲烷，再 次颠倒混匀，室温 静 置 2 min 3 min。4，13000 rpm 离心 10 min。5.3.3 将上层 水相 转入 新 的 1.5 mL 离心管中，加入 等体 积的 异丙醇，颠倒 混匀，室温 放置 10 min。4，13000 rpm 离心 10 min。5.3.4 弃上清 液，加入 1 mL 预冷的 75 乙 醇，洗涤 沉淀。4，13000 rpm 离心 5 min。5.3.5 重复上述 步 骤一 次，彻底 洗净残留 盐 分。5.3.6 弃上清 液，室 温晾 干，加适量 RNase-free H2O 溶 解。用紫外 分光 光度 计测 定 RNA 浓度。放置-80备用。5.4 引物合 成 依据文 献报 道引 物序 列进 行合成（DsMV：Reyes et al.，2009；CMV：姚明 华 等，2009）。引物 配制成10 mol/L 储存液备用。表1 RT-PCR 检 测的 引物 序列 检测病 毒 引物序 列 扩增片 段大 小/bp DsMV 正义引 物：5-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3 反义引 物：5-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-3 1034 CMV 正义引 物：5-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3 反义引 物：5-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3 777 5.5 检测 5.5.1 反转录 合 成 cDNA 第一 链 取 纯化的RNA 合成cDNA 第一链，反应体系为25 L，各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体 积 进行 适当 调 整，反应体 系 成分 见表2。将 上 述试剂 依 次加 入RNase-free 离心管中，混 匀后，放置 于42 恒 温水 浴中1 h后，转 入72 恒温 水浴5 min，用于RT-PCR 扩增 或置-20 以下冰 箱备 用。DB 37/T 38932020 4 表2 反应 体系 成分 表 成分 用量 RNA 1.0 g dNTP（10 mM each）5.0 L 随机引 物（10 mol/L）2.0 L 5 Reverse Transcriptase Buffer 5.0 L RNase 抑 制剂 1.0 L AMV 逆转 录酶（10 U）1.0 L RNase-free H2O 补足 25.0 L 5.5.2 PCR 反应 5.5.2.1 反应体 系 取 合 成的cDNA 第 一链 进行RT-PCR 反 应。反 应体 系中 各 试剂 的量 可根 据具 体情 况 或不 同的 反应总体积进 行适 当调 整。以水 代替模 板作 为空 白对 照。反应体 系成 分见 表3。表3 反应体 系成 分表 成分 用量 2 Es Taq MasterMix 25.0 L 正义引 物（10mol/L）2.0 L 反义引 物（10mol/L）2.0 L cDNA 2.0 L RNase-free H2O 补足 50.0 L 5.5.2.2 反应程 序 将上述 反应 成分 混合 好后，放置PCR 仪进 行反 应，反应程 序参 数见 表4。表4 反应程 序参 数 步骤 温度 时间 预变性 94 2 min 变性 94 30 s 35个循 环 退火 56 30 s 延伸 72 1 min 终延伸 72 5 min 5.5.3 PCR 产 物的 琼脂 糖凝 胶电 泳检测 将50 TAE 电泳缓冲液稀释 成1 TAE 电泳缓冲液，制 备1%的琼脂糖凝胶。取上 述PCR 产 物10 L，加入上 样缓冲液（终 浓度为1），混 匀后移入胶孔，并在 样品孔一侧加 入DNA 分子量标 记。电压大 小根据电 泳槽 长度 确定，一 般控制 在3 V/cm 5 V/cm，当溴 酚蓝 指示 带移 动到 凝胶2/3 处时 关闭 电源。电泳结束 后，在凝 胶成 像仪 的紫外 透射 光下 观察 是否 扩增出 预期 的特 异性 条带，拍摄 并记 录。DB 37/T 38932020 5 6 结果判 定及 表述 6.1 结果判 定 6.1.1 阴性对 照和 空白 对照 未出 现条带，阳 性对 照出 现预 期大小 的扩 增条 带（芋花 叶病毒：1034 bp；黄瓜花 叶病 毒：777 bp），待测 样品 未出 现预 期大 小的扩 增条 带，则可 判断 样品为 阴性。6.1.2 阴性对 照和 空白 对照 未出 现条带，阳 性对 照及 待测 样 品出现 与所 测病 毒预 期大 小 的扩 增条 带（芋花叶病 毒：1034 bp；黄 瓜 花叶病 毒：777 bp），则 判定 样 品检 测 结 果为 阳性。6.1.3 阴性对 照 或 空白 对照 出现 条带，阳性 对照 未出 现预 期大小 扩增 条带，出 现以 上情况 之一，则 不予判定，重 新鉴 定。6.2 结果表 述 检出结 果表 述如 下：a)待测样 品中 检出 芋花 叶病 毒或未 检出 芋花 叶病 毒；b)待测样 品中 检出 黄瓜 花叶 病毒或 未检 出黄 瓜花 叶病 毒。_
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