玉米品种及纯度鉴定技术规程 SNP标记法DB32／T 3860-2020.pdf

ICS 65.020.20 B 21 DB32 江苏省地方标准 DB 32/T 3860 2020 玉米 品种 及 纯度鉴定 技术规 程 SNP 标记法 Technical regulation for identification of maize varieties and purity SNP marker method 2020-10-13 发布 2020-11-13 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 38602020 I 前 言 本 标准 按照GB/T 1.12009 给出 的规 则起 草。本标准 由 江 苏省 农业 科学 院 提出 并归 口。本标准 起草 单位：江 苏省 农业科 学院。本标准 主要 起草 人：赵涵、张体 付、吕远 大、陈艳 萍、林 峰、陆海 燕、梁帅 强。DB32/T 38602020 1 玉米 品种 及 纯度鉴定 技术 规程 SNP 标 记法 1 范围 本标准 规定 了利用 SNP（single nucleotide polymorphism）标记进 行玉米 品种 及 纯度 鉴定 的原 理、仪器设备 及 试 剂、引物 信息、操作 步骤 等要 求。本标准 适用 于玉米 自 交系、单交 种 及 纯度 的鉴 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日 期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 3543.2 农作 物种 子 检验规 程 扦样 GB/T 3543.4 农 作物 种子 检验规 程 发芽 试验 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 SNP 标记 single nucleotide polymorphism marker 基于单 核苷 酸多 态性 的分 子标记。3.2 推荐引 物 recommended primer 品种鉴 定中 优先 选用 的一 套 SNP 引物，其 检测 位点 多态性 高，检测 结果 重复 性好。3.3 竞争性 等位 基因 特异 性 PCR（KASP,Kompetitive Allele Specific PCR）通过引 物末 端特 异性 碱基 竞争性 匹配 DNA 模板 实现 SNP 基 因分 型的 链式 聚合 酶反应。3.4 品种纯 度 varietal purity 品种在 DNA 分子 标记 基因 分型方 面一 致的 程度，用 供检样 品中 本品 种的 种子 数占供检 样 品种 子总数的百 分率 表示。DB32/T 38602020 2 4 原理 玉 米 基 因 组 中 普 遍 存 在 着 单 碱 基 的 变 异，不 同 品 种 同一 SNP 位点的基 因 型 可 利 用 适 宜 引 物 通 过 KASP 检出，进 而根 据 SNP 位点 基因 型的 差异 鉴定 品种及 纯度。5 仪器设 备及 试剂 见附录A。6 引物信 息 见附录B。7 操作步 骤 7.1 样品 DNA 提取 7.1.1 样品准 备 试验样 品 种 子的 分样 与保存，应 符合GB/T 3543.2 的 规定。7.1.2 用于品种 鉴 定样 品 DNA 提取 从送检 样品 中随 机抽 取 10 粒种子 发 苗。分 单株 剪取 100 mg 幼苗用 液氮 研磨，将 研磨粉 末转 入 2 mL 离心管，加入 0.5 mL 2 CTAB 提 取缓 冲液 充分 混匀。在55 65 恒浴 30 min。加入 1 mL 氯仿:异戊醇（24：1），充 分摇动 5 min，8 000 g，室温下离心 5 min。取上清液加入0.6 体积异丙醇，室 温下 静置 30 min，5 000 g，4 离心 5 min。沉 淀用 0.8 mL 高盐 缓冲 液充 分溶 解，15 000 g 离心 2 min。上清加入 0.6 体积异丙醇，室 温下 静置 30 min，5 000 g，4 离心 5 min。沉淀用 400 L 双蒸水溶解，加入 2.5 体积 95%的 预冷 乙 醇，20 冰箱 放置 2 h 以上，15 000 g 离心 20 min。用 70%的预冷 乙 醇洗一次，自然 干燥 后，用 200 L 0.1 TE 缓 冲液 溶解，置 4 保存。注：以上为 推荐 用于品种 鉴 定的 DNA 提取 方法，其他 能够 达到 PCR 扩增质 量要 求的 DNA 提取 方法都 适用 于本标准。7.1.3 用于纯 度鉴 定样 品 DNA 提取 按GB/T 3543.4 规 定的 方法，从送 检样 品中 抽取 不少 于 100 粒种 子发苗。分单 株剪取0.5 cm 1 cm长的幼 苗，放入 96 孔 PCR 板的 孔中，每孔 1 株 幼苗 样品。每孔 加入 40 L DNA 提 取试 剂盒 缓 冲液，在沸水 中煮沸 30 s，然后 加入 60 L DNA 提取 试剂 盒 缓 冲液，在沸 水中 煮 沸 2 min，置 4 保存，保存不超 过 7 d。注：以上为 推荐 用于纯 度鉴 定的 DNA 提取 方法，其他 能够 达到 PCR 扩增质 量要 求的 DNA 提取 方法都 适用 于本标准。7.2 PCR 扩增 7.2.1 引物筛 选 用于品 种及 纯度 鉴定 的 40 组推荐 引物 及其 序列 参见 附录B。DB32/T 38602020 3 自行筛选引物时，取 送检 杂交种及 父、母本种子各 5 粒，通过 KASP 对一系 列 SNP 分子标记引 物进行筛 选，确定 适宜 的引 物。适 宜引 物应 为能 够清 晰区分 杂交 种及 其父、母 本的共 显性 引物。7.2.2 PCR 反 应体 系 在 5 L 的反应体系 中 进 行 扩 增。反应体系包含 0.07 L 引物 KASP Assay mix，2.5 L 2 KASP Master mix，50 ng 模板 DNA。扩增 反应 条件 为：PCR 程序为 94 预 变性 15 min；94 变性 20 s，61 退火和延伸 60 s，10个循 环,每个循环降低 0.6；94 变性 20 s，55 退火和延伸 60 s，26 个循环。反 应利用 96 孔 PCR 板在 PCR 扩 增仪 上进 行。7.3 基因分 型检 测 在微孔 板荧 光分 析仪 上读 取荧光 信号,使用 荧 光结 果处理 软件 按照 分型 明确、NTC(无 样品 阴性 对照)无特 异性 扩增 的原 则进 行样品 SNP 分型。7.4 数据采 集与 判定 7.4.1 数据记 录 纯合位 点的 基因 型数 据记 录为 X/X 和 Y/Y，其中 X、Y 为 同一位点上两个不同的等 位变异；杂合位点的 基因 型数 据记 录为 X/Y；缺 失位 点等 位变 异 数据记 录为-/-。7.4.2 品种鉴定 的 判定 根据送 检样 品在 40 个 SNP 位点 基因 型的 差异 进行 品 种鉴定，具 体判 定标准 如 下：差异位 点数 4，判定 为不 同品种；差异位 点数 1 且 3，判 定为近似 品 种；差异位 点数=0，判 定为 极 近似或 相同 品种。对利用 附录 B 中 40 组 引 物仍未 检测 到 4 个 差异 位 点数的 样品，必 要时 可增 加 自行 筛选 引物 进行检测。7.4.3 纯度鉴 定 的 判定 品种纯 度 按 照下 列公 式计 算：品种纯 度%（自 交系）=（供检种 子粒 数-非本品 种种 子粒数）/供 检种 子粒 数 100%品种纯 度%（单 交种）=（供检种 子粒 数-母本种 子粒 数-其他类型 种子 粒数）/供 检种子 粒数 100%DB32/T 38602020 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）仪器设 备及 试剂 配制 A.1 仪器设 备 仪器设 备包 括：微孔板 荧光 分析 仪；PCR 扩 增仪；电子天 平（感量 0.01 g，0.001 g）；冰箱；微量加 样器（0.1 L 2.5 L,0.5 L 10 L,20 L 200 L,100 L 1 000 L）；磁力搅 拌器；高压灭 菌锅；酸度计 等；离心管（0.5 mL，1.5 mL）；吸头(10 L，200 L，1 000 L)；96 孔 PCR 板；封 板膜；一次性 手套；离心管 架；水平仪。A.2 试剂配制 A.2.1 DNA 提 取试 剂 称取 1 g 氢 氧化 钠溶 于 99 mL 水中。A.2.2 DNA 提 取试 剂 取 10 mL 12 mol/L 的 盐 酸 溶 于 470 mL 水中即成 0.25 mol/L 盐酸。将 0.25 mol/L 盐酸与 0.5 mol/L Tris(PH8.0)按 2：1 稀释。A.2.3 1 mol/L Tris 溶液(PH8.0)称取 121.1 g 三羟甲基氨基 甲烷（Tris），加入 800 mL 双蒸水中溶解，加入浓盐酸 58.4 mL，加水定容至 1 000 mL。A.2.4 0.5 mol/L EDTA 溶 液（PH8.0）称取 186.6 g 乙二 胺四乙 酸 二钠（Na2EDTA2H2O），加入 700 mL 双蒸水中溶 解，加 入 20 g 氢氧化钠，加水 定容 至 1 000 mL。A.2.5 2 CTAB 提 取缓 冲液 DB32/T 38602020 5 2%CTAB（w/v），100 mmol/L Tris(pH8.0)，20 mmol/L EDTA(pH8.0)，1.4 mol/L 氯化钠，1%PVP Mr40 000。称取 20 g 十六 烷基三甲基溴化铵(CTAB)，81.9 g 氯化钠，10 g 聚 乙烯吡咯烷酮（PVP），加入100 mL 1 mol/L Tris 溶液(PH8.0)和 40 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH8.0），加 水定 容至 1 000 mL。A.2.6 高盐缓 冲液 10 mmol/L Tris(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)，1 mol/L 氯化钠。称取 58.5 g 氯化钠,加入 10 mL 1 mol/L Tris 溶液(PH8.0)和 2 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（PH8.0），加水 定容 至 1 000 mL。A.2.7 0.1xTE 缓冲 液 1 mmol/L Tris(pH8.0)，0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)，1 mL 1 mol/L Tris 溶液(PH8.0)和 0.2 mL 0.5 mol/L EDTA 溶 液（PH8.0），加 水定容 至 1 000 mL。A.2.8 2 KASP Master mix 试剂 包含 TaqDNA 聚 合酶、带 有荧光 的接 头序 列、镁 离 子、四种 脱氧 核糖 核苷 酸（dNTP），ROX 内参荧光染 料。A.2.9 KASP Assay mix 包含 46 L ddH2O、12 L 100 mol/L 特 异 性 引 物F1、12 L 100 mol/L 特 异 性 引 物F2、30 L 100 mol/L 通用引物。DB32/T 38602020 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）推荐使 用 的 40 组 SNP 引物序列及 其玉 米 基 因组 分布 推荐使 用的 40 组 SNP 引物 序列及 其玉米 基 因组 分布 见表B.1。表B.1 40 组 SNP 引物 序列 及其 玉 米基因 组分 布 引物名称 染色体 引物序列（5-3）PCR 扩增序列（bp）b 正向a 反向（通用）起始位置 终止位置 扩增长度 JAASKASP1 1 catgtaaataggaaccttgttctcgtA atgtaaataggaaccttgttctcgtC agtcactcaaacatgttcgttgtccaaa 44378152 44378207 56 JAASKASP2 1 tgcattggctgacatggtaC tgcattggctgacatggtaG acttgcagaagctccagagt 112337393 112337472 80 JAASKASP3 1 agcataactaggacaaccattgaT agcataactaggacaaccattgaG ggaactaatggcacggttcc 158201133 158201187 55 JAASKASP4 1 aacatgtgatggtttgggtatgG aacatgtgatggtttgggtatgC cattcgtcaatgatgtgcagct 292751231 292751280 50 JAASKASP5 2 cctcctcccaacaatgtcagcA ctcctcccaacaatgtcagcG gattgtttrtgccatataacttgcaggttt 2501058 2501109 52 JAASKASP6 2 agcattctacatgtcgcgcA agcattctacatgtcgcgcC ggagaacctcgtcgatagcg 87519721 87519771 51 JAASKASP7 2 ttgaaatgttacgaatgtaaggacT ttgaaatgttacgaatgtaaggacC ggctgctctaaattacggca 126341825 126341878 54 JAASKASP8 2 ccactagcagaagcaatgcaaA ccactagcagaagcaatgcaaG gcacacagtttggtgacatgt 236173255 236173312 58 JAASKASP9 3 acatgaagaagagccacgaA acatgaagaagagccacgaG tgcttccagttccaagctcc 10692209 10692274 66 JAASKASP10 3 cctccactttgtcatcgttccA cctccactttgtcatcgttccT tgtgtgccattaatgatgcact 65791039 65791096 58 JAASKASP11 3 tcgagtagtgtaagtggtagcaA tcgagtagtgtaagtggtagcaC acgaattcttgtgctcccca 169180051 169180133 83 JAASKASP12 3 gctagagatccaagatttgtttgtT gctagagatccaagatttgtttgtC gtgaagacggtcgtttgtgc 210902615 210902685 71 JAASKASP13 4 tcacctccttttccggcaaC tcacctccttttccggcaaG gctctgacttggaatgccca 6610435 6610485 51 JAASKASP14 4 gctcttgtgtattcgggcaC gctcttgtgtattcgggcaG aacacatgaagcgagacgga 33728113 33728162 50 JAASKASP15 4 cagatctgattgcttgttattggtA cagatctgattgcttgttattggtG aggagtagctcgatcagatgt 170544513 170544564 52 DB32/T 38602020 7 表B.1 40 组 SNP 引物 序 列 及其玉米 基 因组 分布（续）JAASKASP16 4 ttcccagatctacaacaggatgcA cccagatctacaacaggatgcG cagtgacrtcaccaagcaatctaaagat 239014674 239014734 61 JAASKASP17 5 actttattgtccccagctagttttA actttattgtccccagctagttttG aaattagactgcggctgccc 32482005 32482082 78 JAASKASP18 5 agttagccactctaatctgtccaG tagttagccactctaatctgtccaA aagttaatctakattagctggccttcttgt 71875211 71875264 54 JAASKASP19 5 gcgagcttggattagatagtttgA gcgagcttggattagatagtttgG ctctgcatgacaacctccga 147519030 147519087 58 JAASKASP20 5 cgtatcacaaactcgcacgatT cgtatcacaaactcgcacgatC tggatgaaagtggcgtttgc 174036061 174036119 59 JAASKASP21 6 cattgcaaggctcctgaacA cattgcaaggctcctgaacG ggaaccagagcgcaaacatag 6019073 6019170 98 JAASKASP22 6 acatactctcgacagattagttggA acatactctcgacagattagttggG tcgacgatcagttccgtagc 76399451 76399501 51 JAASKASP23 6 acctctttacaccccttcacaT acctctttacaccccttcacaG aggcaagccatggagtttct 81773959 81774036 78 JAASKASP24 6 ctgctatagtgctagttacatggtA ctgctatagtgctagttacatggtG cgagcagccgtgattttcaa 142274108 142274169 62 JAASKASP25 7 agcactgtgcaacagctaccaC cagcactgtgcaacagctaccaT tccaaaaccactgcaaacataaaggctaa 20258184 20258262 79 JAASKASP26 7 gcggaggtagaaatttgggttT gcggaggtagaaatttgggttA cggcggtggttttgattcag 84880827 84880895 69 JAASKASP27 7 gcatcaccaaagtcaccagtgcA catcaccaaagtcaccagtgcG gctgaagttggcgtcatgatggtta 103535778 103535829 52 JAASKASP28 7 tagcagagctgatcggagcC tagcagagctgatcggagcA tacaagtggtcgtgcgtctt 161388164 161388221 58 JAASKASP29 8 acgaccagatccatgaaaaggatA acgaccagatccatgaaaaggatC tcgacgacaagatgtgggtg 32864435 32864490 56 JAASKASP30 8 agtggttgtttctagccaacA agtggttgtttctagccaacC aaagcagccaaacagaccct 89475855 89475917 63 JAASKASP31 8 tgttattggtggggtgggaA tgttattggtggggtgggaC ttccaccgtccaacagacat 101970990 101971039 50 JAASKASP32 8 ccggttcgatgccacacatA ccggttcgatgccacacatC ggtttgatgcaccaccacac 174841089 174841175 87 JAASKASP33 9 aagcacacctcaggctggaC aagcacacctcaggctggaT gccagctatcatccacaggg 16682227 16682291 65 JAASKASP34 9 catctgttaagttaaggcccttatA catctgttaagttaaggcccttatC gccaagatgggaggtttgga 66329423 66329476 54 JAASKASP35 9 atacgcacagcaggtcagcA atacgcacagcaggtcagcG ccaggaggagacaggatgga 104360117 104360193 77 DB32/T 38602020 8 表B.1 40 组 SNP 引物 序 列 及其玉米 基 因组 分布（续）JAASKASP36 9 cggaggagacctgaatcatctaG cggaggagacctgaatcatctaA agccaaacgacatgaagggt 145631702 145631773 72 JAASKASP37 10 gcatctgggactgctctgaT gcatctgggactgctctgaC gccccagctgtcctactgta 16577851 16577908 58 JAASKASP38 10 ggggattcgaaccaaaccaG ggggattcgaaccaaaccaA ccgatctgtttcgcagccta 63062898 63062951 54 JAASKASP39 10 agtgtgctcctttggaaaacT agtgtgctcctttggaaaacC cgtcgtgcttgtcttctcca 106331559 106331613 55 JAASKASP40 10 agacgccaaatgactaaatccaA agacgccaaatgactaaatccaG gagcaaccagtttccccagt 144274187 144274242 56 a 每组正向引物上面序列 为 F1，由 FAM 荧光标记；下面序列 为 F2，由HEX 荧光标记；变异 碱基由序列尾部大写字母表示。b 起始及终止位置基于 B73 参考 基因组（V3）。_