昭通市马铃薯脱毒苗生产技术规程DB5306／T 19—2019.pdf

I C S 6 5.0 2 0.2 0B 2 1DB5306昭 通 市 地 方 标 准D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 9代 替 D G 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 4昭 通 市 马 铃 薯 脱 毒 苗 生 产 技 术 规 程2 0 1 9-1 1-1 5 发 布 2 0 1 9-1 1-1 5 实 施昭 通 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 9I前 言本 规 程 按 照 D B/T 1.1 2 0 0 9 规 程 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 规 程 由 云 南 省 昭 通 市 农 业 科 学 院 提 出。本 规 程 由 昭 通 市 农 业 农 村 局 归 口。本 规 程 起 草 单 位：昭 通 市 农 业 科 学 院。本 规 程 主 要 起 草 人：宋 维 际、李 灿 辉、张 清 凤、胡 祚。本 规 程 代 替 了 D G 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 4。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 91昭 通 市 马 铃 薯 脱 毒 苗 生 产 技 术 规 程1 范 围本 规 程 规 定 了 马 铃 薯 脱 毒 核 心 苗、基 础 苗、栽 培 苗 的 生 产 技 术。本 规 程 适 用 于 昭 通 市 马 铃 薯 脱 毒 核 心 苗、基 础 苗、栽 培 苗 生 产。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B 5 7 4 9 生 活 饮 用 水 卫 生 规 程G B 1 8 1 3 3 马 铃 薯 脱 毒 种 薯N Y/T 1 2 1 2 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 繁 育 技 术 规 程N Y/T 1 6 0 6 马 铃 薯 种 薯 生 产 操 作 技 术 规 程Y Y 0 5 6 9 生 物 安 全 柜3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 规 程。3.1 脱 毒 核 心 苗通 过 茎 尖 剥 离 获 得 的 符 合 G B 1 8 1 3 3 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 的 再 生 苗。3.2 基 础 苗用 核 心 苗 扩 繁 的 苗，基 础 苗 一 般 为 核 心 苗 第 一 代 起 继 代 扩 繁 2 2 代 2 代，即 核 心 苗 在 保 苗 期 间 继 代 5代 7 代，基 础 苗 在 扩 繁 栽 培 苗 期 间 扩 繁 继 代 1 5 代 2 代。3.3 栽 培 苗用 密 封、透 明、耐 高 温 的 材 料 如 玻 璃 瓶、耐 高 温 塑 料 袋 作 容 器，以 生 产 为 目 的，快 速 繁 殖 后 可 用 于移 栽 的 马 铃 薯 脱 毒 苗。3.4 培 养 基为 马 铃 薯 脱 毒 苗 的 生 长、发 育 提 供 所 需 物 质 的 支 撑 物。3.5 母 液将 培 养 基 的 成 份 配 制 成 相 应 浓 度 的 溶 液 或 混 合 溶 液。3.6 接 种在 无 菌 条 件 下，将 处 理 好 的 植 物 组 织 材 料 放 置 到 培 养 基 上 的 操 作 过 程。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 924 脱 毒 种 苗 生 产4.1 仪 器、器 皿 与 试 剂4.1.1 仪 器 设 备 与 器 皿高 压 灭 菌 锅、超 净 工 作 台、0.0 1 g 感 量 天 平、0.0 0 0 1 g 感 量 天 平、空 调、光 照 培 养 箱、冰 箱、光 照培 养 架、紫 外 灯、枪 状 镊、专 用 组 培 剪、接 种 器 械 电 热 灭 菌 器、培 养 室、温 度 计、培 养 皿、带 透 气 盖 的组 培 瓶、烧 杯、量 筒、医 疗 手 推 车、周 转 用 箱。4.1.2 试 剂7 5 酒 精、甲 醛、高 锰 酸 钾、泛 酸 钙、氢 氧 化 钠、盐 酸、M S 培 养 基（M u r a s h i g e a n d S k o o g,1 9 6 2）所 含 试 剂。4.1.3 培 养 基 制 作培 养 基 制 作 按 附 录 A 进 行，质 量 标 准 按 附 录 B 执 行。4.2 房 间 安 排 及 要 求4.2.1 灭 菌 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 高 压 灭 菌 锅、空 调、配 制 培 养 基 的 不 锈 钢 桌、灌 装 机、电 磁 炉、水 池、拖 把 池。墙 面 及 房 间 顶 部 贴 墙 砖，地 面 铺 白 色 防 滑 地 板 砖。4.2.2 接 种 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 超 净 工 作 台、接 种 器 械 电 热 灭 菌 器、空 调、医 疗 手 推 车、4 0 W 紫 外 灯 1 2 盏。接 种 室 须 设 缓 冲 间 于 进 门 处 与 室 内 间 距 1 0 0 c m，用 5 m m 白 玻 璃 隔 断，隔 断 玻 璃 上 贴 警 示 彩 条，进 培 养室 的 门 须 与 隔 断 门 对 角 开；玻 璃 窗 为 双 层 密 封 窗，雨 天 降 雨 0.5 h 后 可 开 窗 换 气；墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.3 光 照 培 养 室4.2.3.1 光 照 培 养 室 建 设培 养 室 宜 建 成 四 面 为 落 地 窗、顶 部 布 5 0%比 例 玻 璃 的 密 闭 环 境，墙 面 刮 腻 子 灰 滚 白 乳 胶 漆 或 贴 白墙 砖；地 面 铺 白 色 防 滑 地 板 砖；如 顶 部 为 全 玻 璃，须 安 装 7 5%遮 阳 网，夏 季 加 盖 一 层 5 0%遮 阳 网；顶 部安 装 F F U；门 的 密 封 性 要 好，以 免 灰 尘 进 入。如 整 体 房 间 1 0 0，应 用 玻 璃 隔 开，隔 断 玻 璃 上 贴 警 示彩 条，每 个 单 元 安 装 一 台 立 柜 式 空 调，以 便 节 能。4.2.3.2 培 养 架 制 作 和 摆 放用 万 能 角 钢（表 面 喷 白 色 漆）制 作 成 层 高 4 0 c m，长 宽 依 光 照 培 养 室 大 小 设 计 制 作，层 隔 板 用 3.8 m m白 玻 璃；培 养 架 之 间 摆 放 间 距 为 6 0 c m。4.2.4 药 品 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 药 品 柜、天 平、冰 箱，墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.5 洗 涤 室D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 93室 内 主 要 仪 器 设 备 是 洗 瓶 机、洗 涤 池、不 锈 钢 桌，墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.6 贮 藏 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 货 架，墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.7 培 养 基 储 备 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 空 调，货 架，墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.8 病 毒 检 测 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 酶 标 仪、洗 板 机、冰 箱、解 剖 镜、显 微 镜，墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.9 生 化 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 光 照 培 养 箱、生 化 培 养 箱、冰 箱，墙 面、地 面 处 理 同 4.2.1。4.3 脱 毒 核 心 苗 的 获 取4.3.1 选 材选 择 种 植 在 2 5 0 0 m 高 海 拔 地 区、具 有 本 品 种 特 性 的 优 良 健 壮 单 株 的 薯 块，或 本 品 种 的 原 原 种 5 0个 以 上，待 芽 长 出 1 c m 以 上 时 备 用。4.3.2 高 温 处 理将 选 中 的 带 芽 薯 块 放 置 于 于 3 7 3 7.5 的 光 照 培 养 箱 内 9 周 1 0 周，在 高 温 处 理 过 程 中 及 时 拣出 腐 烂 或 芽 已 全 部 死 亡 的 薯 块。4.3.3 茎 尖 剥 离4.3.3.1 外 材 消 毒切 下 芽 顶 部（0.5 c m），放 置 于 用 7 5%酒 精 进 行 表 面 消 毒 过 的 烧 杯 中，上 用 干 净 纱 布 封 口，置 于 自来 水 下 冲 洗 数 小 时；将 冲 洗 过 的 茎 尖 用 7 5%酒 精 消 毒 3 s 5 s，置 于 0.1%升 汞（H g C l 2）溶 液 中 消 毒 5 m i n。然 后 在 无 菌 水 冲 洗 8 次 1 0 次。4.3.3.2 茎 尖 剥 离在 超 净 工 作 台 上、4 0 双 筒 解 剖 镜 下 用 烧 红 冷 却 后 的 解 剖 针 挑 取 茎 尖 顶 部 0.1 m m 带 1 2 个 叶 原 基 的组 织。4.3.4 茎 尖 培 养4.3.4.1 培 养 基M S 0.0 5 m g/L N A A 0.0 5 m g/L 6-B A4.3.4.2 培 养 条 件将 培 养 瓶 放 置 于 3 0 0 0 l u x 的 洁 净 光 照 培 养 室 内，温 度 2 2 2 5，光 照 1 2 h/d。4.3.5 扩 繁待 长 成 带 4 个 5 个 真 叶 的 小 植 株 进 进 行 扩 繁 出 5 瓶 8 瓶，每 瓶 1 0 苗。操 作 按 附 录 C 执 行。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 944.3.6 送 检将 扩 繁 后 的 瓶 苗 送 检，检 测 对 象 为 G B 1 8 1 3 3 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 所 列 的 病 原 物。4.3.7 扩 繁 微 型 薯将 合 格 的 数 个 茎 尖 苗 扩 繁 后 在 防 虫 网 室 中 各 生 产 微 型 薯 1 0 0 粒 以 上。4.3.8 田 间 签 定对 各 茎 尖 的 微 型 薯 在 春 季 种 植 在 二 年 内 未 种 植 过 马 铃 薯 的 大 田 中 进 行 品 种 真 实 性 签 定。4.3.9 扩 繁 基 础 苗根 据 计 划 所 需 苗 量 和 栽 苗 时 间 扩 繁 基 础 苗。操 作 按 附 录 C 执 行。4.3.1 0 基 础 苗 检 测在 扩 繁 栽 培 苗 前 采 用 五 点 取 样 法，随 机 抽 取 1 2 的 基 础 瓶 苗 进 行 检 测。检 测 方 法 应 符 合 G B1 8 1 3 3 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 附 录 的 要 求。确 认 无 检 测 对 象 后，方 可 扩 繁 栽 培 苗。4.4 栽 培 苗 的 培 养 与 炼 苗4.4.1 培 养把 接 种 好 的 瓶 苗 置 于 2 2 2，光 照 强 度 3 0 0 0 l u x 5 0 0 0 0 l u x，光 照 时 间 1 4 h/d 的 培 养 室 内 进 行培 养。3 月 9 月 培 养 2 0 d 左 右、1 0 月 翌 年 2 月 培 养 2 5 d 左 右，可 获 得 具 有 5 片 6 片 小 叶、高 6 c m 左 右的 小 苗4.4.2 炼 苗将 室 内 培 养 的 苗 在 移 栽 前 5 d 7 d 置 于 有 遮 光 和 控 温 设 施 的 炼 苗 室 或 荫 棚 内 炼 苗，温 度 和 光 照 强 度分 别 控 制 在 2 5 2、3 0 0 0 l u x 5 0 0 0 0 l u x。4.4.3 栽 培 苗 质 量苗 高 5 c m 8 c m，茎 粗 1 m m，具 有 明 显 叶 柄 的 小 叶 5 片，根 白 色 至 浅 黄 色，根 系 完 整。4.5 栽 培 苗 的 清 洗 与 消 毒将 瓶 苗 取 出，置 于 自 来 水 中 漂 洗 3 次 4 次。对 附 着 的 培 养 基 则 用 拇 指 与 食 指 轻 压 反 复 漂 洗 除 去，切不 可 搓 捻，以 防 损 伤 苗 而 影 响 成 活 率。漂 洗 干 净 后 即 可 用 0.0 5 的 高 锰 酸 钾 溶 液 浸 泡 1 0 m i n 2 m i n进 行 消 毒，也 可 用 5 0 0 倍 8 0 0 倍 的 百 菌 清 或 甲 基 托 布 津 浸 泡 处 理。5 组 培 室 卫 生按 附 录 D 执 行。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 95A A附 录 A（规 范 性 附 录）培 养 基 制 作A.1 母 液 配 制M S 培 养 基 母 液 配 制 表母液 化合物 1 L 用量(m g)放大倍数 称量数(g)母液体积(m l)配制 1 L 培养基需母液量(m l)A N H 4 N O 3K N O 3M g S O 4 7 H 2 OK H 2 P O 4C a C l 2 H 2 O1 6 5 01 9 0 03 7 01 7 04 4 02 0 3 3 03 8 07 43 48 81 0 0 0 0 5 0B F e S O 4 7 H 2 ON a 2-E D T A2 7.83 7.31 0 0 0 2 7.83 7.35 0 0 0 5C M n S O 4 4 H 2 OZ n S O 4 7 H 2 OH 3 B O 3K IN a 2 M o 4 2 H 2 OC u S O 4 5 H 2 OC o C l 2 6 H 2 O2 2.38.66.20.8 30.2 50.0 2 50.0 2 51 0 0 0 2 2.38.66.20.8 30.2 50.0 2 50.0 2 51 0 0 0 1D 肌醇 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 5 0 0 0 5E 盐酸硫胺素（V B 1）盐酸吡哆醇（V B 6）烟酸（V p p）甘氨酸0.10.50.521 0 0 0 0.10.50.521 0 0 0 1F 泛酸钙 2 1 0 0 0 2 1 0 0 0 1注：母液配制要求分别溶解后再定容。在配制母液 A 时氯化钙最后加入并且溶液体积不少于总体积的 4/5。在配制母液 B 时定容前应煮沸 3 0 分钟左右保证充分螯合。A.2 培 养 基 配 制A.2.1 培 养 基 配 方D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 96马 铃 薯 脱 毒 种 苗 生 产 培 养 基 采 用 M S 泛 酸 钙 2 m g/L+蔗 糖 3 0 g/L+琼 脂 粉 4.2 g 5.2 g/L（依 琼 脂 粉 的强 度 标 准 定 量，以 不 软 不 硬 为 准）。A.2.2 琼 脂 粉 的 溶 化在 洁 净 的 不 锈 钢 锅 里 加 入 配 制 体 积 4/5 左 右 的 清 澈 自 来 水，加 入 所 需 的 琼 脂 粉，置 于 电 磁 炉 上 煮 沸直 至 琼 脂 完 全 溶 化 为 止。A.2.3 白 糖 的 溶 化把 所 需 的 药 品 和 蔗 糖（或 食 用 白 糖）加 入 琼 脂 溶 液 中。A.2.4 定 容加 入 清 澈 的 自 来 水 并 最 终 定 容 至 所 需 体 积。A.2.5 调 整 p H 值充 分 混 合 后 用 1 N 的 K O H（N a O H）或 H C l 调 整 p H 值 至 5.8 6.0。A.2.6 核 查 各 种 物 质仔 细 检 查 各 添 加 物 品 是 否 完 全、正 确，如 无 遗 漏 或 差 错 即 可 分 装。A.2.7 分 装在 培 养 基 完 全 凝 固 以 前 按 照 分 装 量（3 0 m l/2 4 0 m l 瓶，厚 度 1 8 m m 1 m m）进 行 分 装，分 装 时 注 意 培 养基 不 沾 培 养 瓶 口，分 装 完 毕 后 尽 快 拧 紧 瓶 盖，然 后 及 时 进 行 消 毒 灭 菌。A.2.8 如 用 灌 装 机 制 作，按 灌 装 机 操 作 规 程 重 复 A 2.2 A 2.7 程 序。A.3 培 养 基 灭 菌A.3.1 装 锅培 养 基 瓶 在 灭 菌 锅 内 不 得 倾 斜。A.3.2 卧 式 高 压 锅 灭 菌装 锅 前 检 查 进 水 水 管 是 否 妥 善 连 接 水 箱 进 水 管，是 否 无 漏 水 现 象，将 水 箱 工 作 开 关 调 至“加 热”位置，观 察 加 水 指 示 灯 是 否 正 常 加 水。设 置 参 数 为 灭 菌 室 温 度 1 2 1（灭 菌 室 相 应 压 力 0.1 4 M p a），灭 菌 时间 2 5 m i n，排 气 设 置 为“微 排”。A.3.3 立 式 高 压 灭 菌 锅装 锅 前 关 紧 放 水 阀，往 外 桶 内 加 入 自 来 水，水 位 至 灭 菌 桶 搁 脚 处（挡 水 板 下），装 入 盛 有 培 养 基 半成 品 的 组 培 瓶 后，关 闭、锁 紧 灭 菌 锅 盖，按 锅 上 设 置 按 键 设 定 A 3.2 条 的 灭 菌 参 数（灭 菌 时 间 设 置 为 3 0 m i n），灭 菌 结 束 蜂 鸣 声 响 起 后 关 闭 电 源，待 其 冷 却 直 至 压 力 表 指 针 回 至 零 位 时 打 开 放 汽 阀 排 尽 余 汽，打 开 外 桶盖 才 能 取 出 灭 菌 物。A.4 灭 菌 后 的 物 品 应 及 时 转 运 至 培 养 基 储 备 室 摆 放 整 齐。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 97B B附 录 B（规 范 性 附 录）容 器 和 培 养 基 质 量 标 准B.1 用 瓶 质 量 标 准B.1.1 培 养 容 器 为 广 口 罐 头 透 明 玻 璃 瓶。B.1.2 洗 涤洗 涤 溶 液 为 清 澈 透 明 加 有 洗 衣 粉 的 自 来 水，在 2 5 水 温 下，洗 衣 粉 用 量（0.1 6 g 0.1 7 g/L）。B.1.3 裂 损 瓶 定 义瓶 口 缺 口 超 过 5 m m 的 和 裂 纹 瓶。B.1.4 洗 后 质 量 标 准B.1.4.1 瓶 内 无 残 存 洗 衣 粉，检 测 方 法 是 用 未 沾 有 洗 衣 粉、肥 皂、洗 洁 精 等 洗 涤 物 质 的 湿 手 指，擦 试新 洗 出 的 瓶 内、外 壁 无 滑 溜 感。B.1.4.2 表 面 无 原 有 标 签 印 记。B.1.4.3 瓶 内 外 壁 无 污 物、无 污 痕。B.1.4.4 洗 净 瓶 的 摆 放 和 晾 贮洗 净 后 的 瓶 需 反 扣 在 周 转 箱 或 筐 中，堆 码 在 干 净 干 燥 处，堆 码 高 度 不 超 过 1 5 0 c m，码 在 桌 子 上 的 可堆 到 1 6 0 c m，用 前 瓶 内 外 不 能 有 明 显 的 水 痕。B.2 培 养 基B.2.1 培 养 基 种 类M S+蔗 糖 3 0 g/L，琼 脂 4.5 5.0 g/L，灭 菌 前 p H 5.8 6.0。B.2.2 配 制 母 液 用 水纯 净 水。B.2.3 母 液 的 存 放配 制 好 的 母 液 贮 存 在 塑 料 桶 或 玻 璃 瓶 内，标 记 清 楚 后，除 大 量 元 素 外 都 存 放 在 4 5 的 冰 箱 内。各 母 液 桶（瓶）一 旦 标 记 好 后，今 后 不 能 调 换 使 用，下 次 使 用 时 只 能 贮 存 同 一 种 贮 备 母 液。B.2.4 配 制 培 养 基 用 水清 澈 透 明 的 自 来 水。B.2.5 培 养 基 用 量D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 98B.2.5.1 用 2 4 0 m l 瓶 做 栽 培 苗 时，培 养 基 厚 度 为 1 8 m m 1 m m；每 瓶 培 养 基 灌 装 量 为 3 0 m L 1.5 m L，每 升培 养 基 灌 装 3 3 瓶 1 瓶。B.2.5.2 用 3 5 0 m l 瓶 在 做 栽 培 苗 时，培 养 基 厚 度 为 1 8 m m 1 m m；每 瓶 培 养 基 灌 装 量 为 4 8 m L 1.5 m L，每 升培 养 基 灌 装 2 1 瓶 1 瓶。B.2.6 培 养 基 半 成 品 的 熬 制B.2.6.1 按 预 定 的 用 量 称 取 琼 脂 和 白 糖，分 别 存 放 在 搪 瓷 钵 等 容 器 内。B.2.6.2 在 用 于 熬 制 培 养 基 半 成 品 的 钢 精 锅 作 好 1 0 L、2 0 L 的 水 位 标 记 线。B.2.6.3 用 钢 精 锅 装 好 预 定 量 3/4 的 清 澈 自 来 水，放 在 电 磁 炉 上 调 至 2 0 0 0 档 位，先 用 冷 水 浸 泡 琼 脂粉 5 m i n，待 水 沸 腾 时 放 入 琼 脂，并 用 不 锈 钢 勺 不 停 搅 动；当 水 快 开 时 将 炉 温 调 至 1 0 0 0 档 位，随 后 往锅 内 倒 入 白 糖，并 用 不 锈 钢 勺 不 停 搅 动，至 琼 脂 白 糖 都 完 全 溶 化 时 关 闭 电 磁 炉，加 入 母 液，并 用 清 水 洗2 次 盛 母 液 的 容 器，再 加 入 余 下 的 水 至 1 0 L 或 2 0 L 的 水 位 线（此 阶 段 称 为 定 容）。经 充 分 搅 拌 后，用 酸 度计 量 p H 值，用 1 N 盐 酸（H C l）或 氢 氧 化 钠（N a O H）或 氢 氧 化 钾（K O H）调 整 p H 值 至 5.8 6.0，再 开 电 磁 炉将 锅 内 培 养 基 半 成 品 烧 至 沸 腾 时 关 闭 电 磁 炉。B.2.6.4 用 不 锈 钢 勺 手 工 分 装 培 养 基 半 成 品 至 组 培 瓶 中，按 B 2.5 培 养 基 用 量 装 入。B.2.6.5 用 灌 装 机 灌 装 培 养 基 半 成 品。以 上 环 节 如 用 灌 装 机 时 按 灌 装 机 操 作 规 程 操 作，当 灌 装 机 内 培养 基 半 成 品 中 的 琼 脂 粉 完 全 溶 化 时，用 酸 度 计 量 p H 值，用 1 N 盐 酸（H C l）或 氢 氧 化 钠（N a O H)调 整 p H 值 至5.8 6.0，再 打 开 灌 装 开 关 分 装 培 养 基 半 成 品 至 组 培 瓶 中。B.2.7 1 N 盐 酸（H C l）和 1 N 氢 氧 化 钠（N a O H)的 配 制B.2.7.1 1 N 盐 酸 即 取 9 0 m L 3 7.0 1%的 盐 酸（H C l）加 入 1 0 0 0 m L 纯 净 水 中 轻 摇 匀。B.2.7.2 1 N 氢 氧 化 钠（N a O H）的 配 制 即 称 4 0 g 氢 氧 化 钠（N a O H)溶 于 1 0 0 0 m L 纯 净 水 中 溶 解。B.2.8 成 品 培 养 基 的 存 贮成 品 培 养 基 堆 码 高 度 不 超 过 1 5 0 c m（码 在 桌 子 上 不 超 过 1 6 0 c m），摆 放 在 干 净 干 燥 处，即 空 气 洁 净度 3 0 万 级，温 度 2 3 1、相 对 湿 度 3 0%4 0%的 密 闭 环 境 内。室 内 屋 顶 每 1 0 装 4 0 W 紫 外 灯 管 1 支 或 每2 0 房 间 安 装 臭 氧 发 生 量 4 7 g/h 的 臭 氧 消 毒 机 1 台。B.2.9 培 养 基 存 贮 后 的 质 量 标 准B.2.9.1 外 在 质 量培 养 基 保 持 正 常 的 凝 固 状 态，即 将 瓶 倾 斜 4 5 角 5 s 后 培 养 基 不 流 淌、轻 晃 瓶 后 培 养 基 不 散；表 面 平整 光 滑；瓶 口 以 下 内 外 壁 均 无 培 养 基；培 养 基 内 有 少 量 的 直 径 为 1 m m（芝 麻 大 小）以 下 气 泡 为 正 常 现 象；瓶 盖 松 脱 率 0.5%、破 损 率 0.5%。B.2.9.2 内 在 质 量存 贮 5 天 后 的 污 染 率 0.5%。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 99C C附 录 C（规 范 性 附 录）无 菌 操 作 技 术C.1 接 苗 前 的 准 备C.1.1 超 净 工 作 台 的 使 用超 净 工 作 台 标 准 须 符 合 Y Y 0 5 6 9-2 0 0 5 生 物 安 全 柜 标 准。开 启 电 源 开 关，启 动 鼓 风 机 使 超 净 工 作 台处 于 工 作 状 态，同 时 打 开 超 净 工 作 台 上 的 紫 外 灯 对 超 净 工 作 台 的 台 面 进 行 消 毒（接 种 时 关 闭），2 0 m i n后 即 可 使 用。C.1.2 开 启 室 内 紫 外 灯 3 0 m i n。C.1.3 换 鞋。C.1.4 洗 手，先 用 洗 手 液 洗，在 自 来 水 上 冲 洗 2 3 m i n，再 用 7 5%酒 精 喷 手 抹 匀。C.1.5 穿 戴 整 齐 工 作 服、口 罩、帽 子，将 手 机 存 入 衣 帽 柜。C.1.6 关 闭 紫 外 灯。C.1.7 检 查 接 种 室 窗 子 是 否 完 全 关 闭，如 有 开 着 的 窗 子，应 关 闭。C.1.8 将 当 节 或 当 天 需 用 的 培 养 基、灭 过 菌 的 吸 水 纸（每 人 每 节 工 作 时 间 两 包 灭 菌 纸）等 送 入 接 苗室。C.1.9 每 个 接 苗 时 段 只 能 安 排 一 个 编 号 的 基 础 苗 进 入 接 种 室。C.1.1 0 将 灭 过 菌 的 镊 子、剪 刀 插 入 灭 菌 器 内 灭 菌，8 5 0 电 热 灭 菌 器 应 严 格 按 使 用 说 明 书 轻 插 器 具、每 隔 3 h 调 至 低 温 档 冷 却 后 才 重 新 调 至 8 5 0 使 用 的 规 定。C.1.1 1 核 查 基 础 苗 的 标 签 是 否 完 整 和 有 无 污 染。C.1.1 2 用 酒 精 擦 试 超 净 工 作 台 内 腔 壁 等 接 种 仪 器、工 具。C.1.1 3 将 一 次 所 需 接 苗 量 的 培 养 基（4 8 瓶）用 7 5%酒 精 擦 试 后 摆 在 超 净 工 作 台 一 侧。C.2 接 苗C.2.1 检 查 核 实 当 节 各 自 的 基 础 苗 的 编 号 是 否 完 全 为 同 一 个 编 号、标 签 是 否 完 整 无 误、是 否 有 污 染。C.2.2 用 7 5%酒 精 浸 湿 灭 过 菌 的 吸 水 材 料 如 纯 棉 口 罩 或 小 手 帕 擦 试 培 养 基 瓶 和 基 础 苗 瓶。C.2.3 将 灭 过 菌 的 吸 水 纸 用 镊 子 夹 出 后 反 铺 在 超 净 工 作 台 上，每 次 四 张、各 两 层。C.2.4 轻 旋 松 开 培 养 基 瓶 盖。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 91 0C.2.5 以 一 瓶 基 础 苗 为 一 个 接 苗 单 元，用 灭 好 菌 并 冷 却 了 的 剪 刀 在 瓶 内 将 苗 从 基 部 剪 断，并 用 剪 刀 夹出 轻 放 在 吸 水 纸 上，在 此 操 作 过 程 中 瓶 口 不 得 离 开 超 净 工 作 台 送 风 区 域。C.2.6 将 每 一 苗 剪 成 带 有 1 个 叶 片 的 茎 段，苗 尖 部 分 带 2 个 以 上 完 整 叶 片，苗 尖 部 分 另 放；过 长 茎 段 上如 无 小 叶 应 剪 除。C.2.7 将 培 养 基 瓶 盖 取 放 在 超 净 工 作 台 或 待 用 的 培 养 基 瓶 上，盖 口 向 上。C.2.8 将 茎 段、苗 尖 分 开 均 匀 正 插（苗 要 插 入 培 养 基 1 m m）或 平 铺 于 培 养 基 表 面，平 铺 时 应 使 苗 与 培养 基 紧 密 接 触。每 瓶 接 苗 数 量 按 不 同 品 种、时 间 的 规 定 接 入 茎 段 量。C.2.9 每 接 完 一 瓶 应 及 时 轻 盖 好 已 接 好 苗 的 瓶 子，盖 时 瓶 盖 不 得 擦 碰 到 瓶 外 壁，待 接 完 一 瓶 基 础 苗（母瓶）后 再 将 接 好 苗 的 瓶 子 盖 紧 或 扎 紧。C.2.1 0 每 接 完 一 个 编 号 的 苗 均 应 及 时 在 瓶 上 写 上 与 基 础 苗（母 瓶）完 全 一 致 的 编 号，再 写 接 苗 人 编号 及 接 苗 时 间。C.2.1 1 接 完 一 瓶 基 础 苗 后 更 换 吸 水 纸、剪 刀、镊 子，并 重 新 擦 试 超 净 工 作 台。C.2.1 2 操 作 过 程 上 不 得 将 接 苗 器 具 离 开 超 净 工 作 台 送 风 区 域，接 苗 器 具 不 得 碰 到 苗、吸 水 纸、瓶 内壁 以 外 的 任 何 器 物 和 地 方。C.2.1 3 接 苗 过 程 中 取 吸 水 纸 时 和 手 的 移 动 均 不 得 在 铺 好 的 吸 水 纸 上 经 过。C.2.1 4 接 苗 过 程 中 剪 刀 和 镊 子 摆 放 时 应 摆 放 在 在 吸 水 纸 上，但 要 注 意 未 进 入 灭 菌 器 灭 菌 的 部 分 不 得 与吸 水 纸 接 触。C.2.1 5 接 苗 过 程 中 不 得 面 对 超 净 工 作 台 咳 嗽 和 频 繁 离 开 超 净 工 作 台。C.3 接 后 工 作C.3.1 每 接 完 一 个 编 号 的 苗 均 应 及 时 将 接 好 的 苗 送 入 培 养 室 按 培 养 室 管 理 规 定 摆 在 培 养 架 上。C.3.2 每 天 接 完 苗 后 均 应 及 时 清 理 接 种 室 内 留 剩 余 的 空 瓶、封 口 膜、扎 瓶 线 及 其 他 需 清 理 的 物 品。C.3.3 关 闭 室 内 超 净 工 作 台 电 源、电 热 灭 菌 器 电 源 和 其 他 电 器 如 取 暖 器 及 空 调 等。C.3.4 将 抹 超 净 工 作 台 的 小 帕 子 晾 于 医 用 手 推 车 的 栏 杆 上,定 期 清 洗 小 手 帕。C.3.5 准 确 记 录 并 于 第 二 天 与 培 养 室 管 理 人 员 核 对 当 天 的 接 苗 品 种 和 数 量。C.3.6 清 洗 接 苗 工 具（剪 刀、镊 子）。C.3.7 关 好 接 种 室。C.3.8 衣 帽、口 罩 摆 放 在 接 种 室 当 晚 用 紫 外 灯 灭 菌。C.4 其 他C.4.1 逢 阴 雨 天 降 雨 3 0 m i n 后 开 窗 换 气 3 0 m i n。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 91 1C.4.2 注 意 超 净 工 作 台 及 其 他 仪 器 的 运 转 是 否 正 常。C.4.3 每 3 个 月 为 一 个 周 期，需 清 洗 或 更 换 超 净 工 作 台 过 滤 网。C.4.4 需 对 接 种 室 进 行 每 月 定 期 甲 醛+高 锰 酸 钾 熏 蒸。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 91 2D D附 录 D（规 范 性 附 录）组 培 室 卫 生 标 准D.1 卫 生 标 准D.1.1 器 具 物 品 卫 生 标 准以 下 仪 器 设 备 表 面 及 常 开 内 腔 壁 应 保 持 无 尘、无 污 渍、无 杂 物、无 碎 玻 璃。D.1.1.1 超 净 工 作 台。D.1.1.2 电 热 灭 菌 器。D.1.1.3 取 暖 器。D.1.1.4 高 压 灭 菌 锅。D.1.1.5 不 锈 钢 工 作 台。D.1.1.6 空 调 外 部、顶 部、叶 扇。D.1.1.7 其 他 物 品 的 内 外 表 面。D.1.2 物 件 堆 放整齐。D.1.3 地 面 卫 生 标 准 接 种 室，走 道，光 照 培 养 室，楼 梯 应 无 残 存 培 养 基、无 线、无 塑 料 膜 等 杂 物。D.1.4 房 间 四 壁 无 污 痕。D.1.5 水 池 所 有 眼 见 部 分 及 滤 渣 箩 筐 和 洗 拖 把 的 桶 应 无 污 斑、无 残 渣、无 碎 玻 璃。D.1.6 拖 把 及 洗 拖 把 桶D.1.6.1 接 种 室、光 照 培 养 室、灭 菌 室、洗 涤 室 应 分 开 用。D.1.6.2 在 桶 里 用 清 水 杵 5 次 水 不 明 显 变 混 浊。D.1.6.3 无 残 渣、头 发 绺。D.1.7 扫 把、撮 箕、垃 圾 箩 无 残 存 培 养 基、无 厚 污 痕、无 残 渣、头 发 绺。D.1.8 培 养 架D.1.8.1 台 面 无 污 痕 和 手 试 后 无 尘。D.1.8.2 万 能 角 钢 无 污 痕。D.1.9 个 人 卫 生D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 91 3D.1.9.1 进 入 组 培 室 前 手、面 部、脚 不 得 有 明 显 污 痕。D.1.9.2 指 甲 不 得 超 过 指 尖、指 甲 内 不 得 有 可 见 污 垢。D.1.9.3 头 发 应 保 持 整 齐 无 明 显 污 痕。D.1.9.4 鞋 袜 无 泥 土，袜 子 须 每 天 清 洗。D.1.9.5 外 衣 外 裤 无 明 显 污 痕，无 泥 土。D.1.1 0 其 他 部 分D.1.1 0.1 衣 帽 口 罩 无 汗 渍、可 去 除 污 痕。D.1.1 0.2 围 腰、袖 套、防 水 手 套 无 明 显 污 痕。D.1.1 0.3 铝 合 金 楼 梯 无 污 痕。D.1.1 0.4 门 及 楼 梯 扶 手 无 污 渍 污 痕 无 肉 眼 可 见 灰 尘。D.1.1 0.5 培 养 室 玻 璃 门 槽 无 残 渣 和 碎 玻 璃。D.1.1 0.6 培 养 室 顶 部 玻 璃 无 明 显 可 见 尘 土。D.1.1 0.7 抹 布 用 清 水 搓 揉 5 秒 钟 后 无 混 浊。D.1.1 0.8 接 种 室 无 苍 蝇、蚊 虫。D.1.1 0.9 灭 菌 室 洗 涤 室 工 作 时 间 内 不 得 有 超 过 1 只 苍 蝇 或 蚊 虫 停 留 3 0 m i n。D.1.1 1 不 得 在 组 培 室 用 餐。D.1.1 2 客 用 白 大 褂 的 酒 精 消 毒 每 周 末（星 期 五 或 星 期 六）用 7 5%酒 精 喷 雾 消 毒。D.2 打 扫 卫 生 时 间D.2.1.1 每 天 必 须 打 扫 的 超 净 工 作 台、电 热 灭 菌 器，走 道、门 厅、楼 梯，拖 把、拖 把 池，洗 瓶 机、灌装 机，不 锈 钢 桌 台 面。D.2.2 每 周 打 扫 2 次 的 高 压 灭 菌 锅，空 调，撮 箕、扫 把、垃 圾 箩 筐。D.2.3 每 两 周 打 扫 1 次 的 除 以 上 两 条 规 定 的 仪 器、设 备、墙 壁、物 件。D.2.4 清 洁 卫 生 开 始 时 间 每 天 下 午 规 定 下 班 时 间 后 开 始。D.3 消 毒 剂 和 清 洁 剂 的 使 用D.3.1 7 5%酒 精D.3.1.1 适 用 物 体 为 手、超 净 工 作 台、地 面，所 有 房 间 顶 部。D.3.1.2 除 地 面、房 间 顶 部 外 天 天 使 用。D.3.1.3 地 面、房 间 顶 部 每 周 二、周 五 使 用。D B 5 3 0 6/T 1 9 2 0 1 91 4D.3.1.4 用 量 以 能 湿 润 物 体 表 面 为 准。D.3.2 肥 皂D.3.2.1 适 用 物 体 为 衣 物、抹 帕。D.3.2.2 用 量 为 能 起 泡 沫 即 可。D.3.3 洗 衣 粉D.3.3.1 适 用 物 体 为 瓶 子、瓶 盖、贴 砖 墙、拖 把、水 池。D.3.3.2 周 一、周 三、周 四 对 清 洁 区 域 用。D.3.3.3 贴 砖 墙 需 用 时 用。D.3.4 洗 手 液D.3.4.1 适 用 物 体 为 手。D.3.4.2 进 入 工 作 区 域 后 初 次 洗 手 用。_ _ _ _ _ _ _ _ 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