烟草疫霉土壤带菌定量技术规程DB53／T 962-2020.pdf

DB53/T 9622020 烟草疫霉土壤带菌定量技术规程 2020-04-26发布 2020-07-26实施ICS 65.160 B 35 云南省地方标准 云南省市场监督管理局 发布 DB53/T 9622020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由云南省烟草专卖局（公司）提出。本标准由云南省烟草标准化技术委员会（YNTC12）归口。本标准起草单位：云南省烟草农业科学研究院、云南农业大学、云南省烟草质量监督检测站、云南省烟草公司大理州公司、云南省烟草公司昆明市公司。本标准主要起草人：方敦煌、肖炳光、夏振远、曾建敏、秦西云、童治军、姬广海、孙浩巍、范志勇、徐兴阳。DB53/T 9622020 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本标准第4.5条与ZL201510635459.3一种土壤烟草黑胫病发病潜力的预测方法相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组织或者个人在实施该地方标准时实施专利。相关信息可通过以下联系方式获得：专利发明人：方敦煌、李永平、肖炳光、曾建敏、童治军 专利权人：云南省烟草农业科学研究院 地址：云南省昆明市五华区圆通街33号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。DB53/T 9622020 1 烟草疫霉土壤带菌定量技术规程 1 范围 本标准规定了烟草疫霉菌定量检测以及土壤带菌量等级划分等要求。本标准适用于烟草疫霉菌的定量检测，烟草疫霉菌土壤带菌量等级划分。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 23222 烟草病虫害分级及调查方法 GB/T 23224 烟草品种抗病性鉴定 GB/T 25241.1 烟草集约化育苗技术规程 第1部分：漂浮育苗 GB/T 25241.2 烟草集约化育苗技术规程 第2部分：托盘育苗 GB/T 25241.3 烟草集约化育苗技术规程 第3部分：砂培育苗 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和储存 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 烟草疫霉菌 烟草疫霉菌（Phytophtora nicotianae Breda）是烟草黑胫病的病原菌，在土壤中以休眠体（如厚垣孢子、菌丝体等）的形态存在，休眠体萌发后形成游动孢子囊，再释放游动孢子侵染烟草。在一个烟草生长季节中能够连续繁殖多代，不断释放游动孢子，通过流水或雨水飞溅传播形成再侵染。4 烟草疫霉菌定量检测 4.1 土样采集与前处理 在土地平整后、理墒前按NY/T 1121.1采集土壤样品，过2 mm筛制备土壤测试样品。4.2 土壤稀释平板菌落计数法定量检测 4.2.1 选择性培养基的制备 选择性培养基按照附录A配制。4.2.2 土壤稀释平板菌落计数法定量 4.2.2.1 土壤悬浮液稀释 DB53/T 9622020 2 称取过筛后的土壤测试样品l0 g，放入250 mL带塞三角瓶中，再加入已灭菌的40 mL 0.25%水琼脂，置于漩涡振荡器上充分混匀，5倍系列稀释，每份土样3次重复。4.2.2.2 涂布平板 吸取5-2、5-3、5-4土壤稀释液各200 L，涂布于选择性培养基平板上，每份样品每个稀释梯度涂布5个平板，置于（2426）恒温培养箱中培养（4872）h后，疫霉菌在选择性培养基上形成丛状菌落。4.2.2.3 菌落计数 挑选菌落形态较易区分、菌落数（称为菌落形成单位 Colony-Forming Units，简称cfu）在（515）个的平板，标记疑似菌落，将同一样品相同稀释度的5个平板中的菌落数相加计数。每1 g土样形成的疑似菌落数计算公式为每1 g土壤（干重）中烟草疫霉菌数量（同一稀释度3次重复的菌落平均数稀释倍数）/（1-土壤含水量）4.2.2.4 校正定量 挑取同一样品（3050）个疑似烟草疫霉菌菌落5 mm5 mm的菌丝块，按照附录B鉴定疑似菌落，判别、统计阳性结果的百分比，以此校正定量各土样中的烟草疫霉菌含量。4.3 荧光定量 PCR 检测 4.3.1 烟草疫霉菌 DNA 提取 按附录B提取烟草疫霉菌DNA，保存于-20 冰箱中备用。4.3.2 荧光定量 PCR 引物 用于荧光定量PCR的特异性引物核苷酸序列为：ParA1 F:5-CATT GAGTAGCCAGAGTCCGTC-3；ParA1 R:5-CCACCACGCAGCAAACTGCGGC-3c。4.3.3 实时荧光定量 PCR 检测 4.3.3.1 反应程序 95 预变性30 s，95 变性5 s，60 退火30 s，72 延伸15 s，40个循环。PCR扩增结束后进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线的程序为：95 1 min，57 1 min，从57 开始每升高0.5 保持10 s，连续升高80次，至95 为止。4.3.3.2 标准曲线构建 利用含烟草疫霉菌DNA目的片段的重组质粒作为标准品，使用SYBR Green荧光染料法，以10倍稀释浓度梯度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR，构建标准曲线，并确定荧光定量PCR的灵敏度。4.3.3.3 土壤检测 按照4.3.1方法提取烟草疫霉菌DNA，利用土壤真菌提取试剂盒提取试点土样总DNA，采用4.3.3.1的反应程序进行荧光定量PCR检测。4.4 叶片诱饵法定量检测 4.4.1 叶片诱饵的制备 DB53/T 9622020 3 以GB/T 23224测定的感黑胫病烟草品种为材料，采用GB/T 25241.1、GB/T 25241.2、GB/T 25241.3任意方法之一育苗，取苗龄3545 d的幼苗移栽至直径10 cm、深（68）cm的小花盆或边长10 cm、深（68）cm的穴盘托盘湿润育苗至（67）叶期，取健康中部叶（12）片，在叶片中部用5 mm打孔器打取叶圆片，作为叶片诱饵。4.4.2 游动孢子的诱捕 4.4.2.1 平板菌丝游动孢子的诱导释放 将烟草疫霉菌活化（23）次，接种至燕麦培养基平板，（2426）培养（710）d，再用10%的V8培养液诱导游动孢子囊，8 低温释放游动孢子。4.4.2.2 游动孢子含量测定 微量加样器取5 L 游动孢子悬浮液，在洁净载玻片上拖成连续细长的薄层条带，显微计数测算孢子浓度。4.4.2.3 带菌土壤悬浮液的制备 取5 g研磨并通过2 mm筛网的灭菌干土均匀混入盛有10 mL 300 cfu/mL、600 cfu/mL、900 cfu/mL、1200 cfu/mL、1800 cfu/mL游动孢子悬浮液的50 mL烧杯中，制备不同浓度梯度的人工添加游动孢子的土壤悬浮液。4.4.2.4 诱捕与计数 土壤悬浮液静置2 h，取叶片诱饵（1520）片漂浮在液面上，叶片诱饵互不重叠，（2426）诱捕（24）h，1020或2020倍显微观察，计数所有叶片诱饵圆片外缘伤口四周诱捕到的游动孢子数量，每浓度梯度重复3次，取平均值作为叶片诱捕游动孢子数量。4.4.3 诱捕量与带菌量的回归分析与验证 以叶片诱捕游动孢子数量（诱捕量）为自变量、土壤悬浮液的游动孢子含量（带菌量）为因变量，采用数据处理软件建立指数回归方程，再用200 cfu/mL、400 cfu/mL、800 cfu/mL、1400 cfu/mL、2000 cfu/mL游动孢子悬浮液对回归方程进行验证。4.4.4 土壤样品实测 4.4.4.1 土壤中游动孢子的诱导释放 取50 g研磨并通过2 mm筛网的土样装入带有下盖的土壤环刀内，置于1/31/2环刀土壤高度的盛水盘内渗透吸水至饱和，去除多余水分，露天静置4 d5 d，期间每1 d早晚喷淋感黑胫病烟草品种烟苗根系分泌物保湿1次，维持土壤含水量的饱和状态，利用白昼温差、间歇喷淋诱导土壤产生并释放游动孢子。4.4.4.2 诱捕计数与带菌量计算 将处理土壤转移至250 mL烧杯内，100 mL灭菌水清洗带有下盖的土壤环刀，并将洗下的水加入烧杯内，搅匀，按4.4.2.4的方法进行诱捕与计数，再将3次测定的平均值代入4.4.3建立的回归方程，计算每1 g土壤样品的带菌量。4.5 感病品种土壤假植测定最高发病率定量带菌量 DB53/T 9622020 4 4.5.1 土壤样品的采集及其栽培基质的制作 测定的田块对角线5点取土样，取样深度为（2030）cm的耕层土壤，每点取（3.05.0）kg，辗碎成粒径为（0.20.5）cm的土壤颗粒，剔除杂物，混匀，洁净水（无烟草病原）湿润，控制土壤含水量为（5565）%，制作为栽培基质，装入长约 30 cm、宽约60 cm、深约15 cm、筛孔边长（0.40.6）cm筛筐内，装土高度（1012）cm每筛筐1个重复，共重复5次，多余的土壤样品分别标示存放备用。4.5.2 感病品种假植与培育 按4.4.1的方法培育幼苗，再挑选生长整齐的烟苗，拔出，剪除1/41/3的末端根系，形成根创伤后，按株距5 cm、行距10 cm移栽至4.5.1的筛筐中，将筛筐置于配套的托盘内，在托盘内注入土壤厚度1/31/2的洁净水，渗透吸水至饱和，去除多余水分，在长（560590）cm、宽（140145）cm、高（100120）cm可拆卸田间塑料小拱棚内静置（45）d，期间每1 d早晚喷淋保湿1次，维持土壤含水量的饱和状态，5 d后向托盘中注水，水的深度为土壤厚度的1/31/2，以维持土壤湿润，在（1528）、相对湿度75%以上、自然光照/黑暗交替的可拆卸田间塑料小拱棚中继续培养。4.5.3 病害调查 移栽烟苗后的第3 d观察发病情况，每7 d调查1次病情，共调查5次，烟草黑胫病以株为单位调查，以产生明显病斑至烟苗凋萎记作发病，以无病斑、烟苗直立、生长正常记作不发病，每发病株采用4.2.2.4或者4.3.3.3方法校验，调查所有烟株，按GB/T 23222计算发病率，直接以最高发病率代替游动孢子数量定量土壤带菌量。5 土壤带菌量等级划分 按照附录C，根据土壤带菌量与病害发生的相关性，可将土壤带菌量等级划分为一级、二级、三级、四级4类：a)一级：土壤带菌量不超过 10 cfu/g，或者假植最高发病率不超过 10%，无论感病的品种或中抗及以上抗性的品种的种植因病原菌菌量低，种植品种发病率低；b)二级：土壤初始带菌量介于 10 cfu/g（含）300 cfu/g（不含），或者假植最高发病率介于10%（含）30%（不含），种植时病害发生风险一般，感病品种适合种植，一般正常防治即可达到较好的病害防治效果；中抗及以上抗性的品种种植时，农业防治即可达到较好的病害防治效果；c)三级：土壤初始带菌量介于 300 cfu/g（含）4500 cfu/g（不含），或者假植最高发病率介于 30%（含）50%（不含），种植时病害发生风险中等，感病品种可以种植，但必需严格防控病害，否则会形成较大程度的损失；中抗及以上抗性的品种适合种植，一般正常防治即可达到较好的病害防治效果；d)四级：土壤带菌量 4500 cfu/g 以上，或者假植最高发病率大于 50%，种植时病害发生风险大，感病品种不适合种植，否则会形成毁灭性病害；中抗及以上抗性的品种可以种植，但必需严格防控病害，否则易造成抗性丧失，缩短抗病品种的生产使用年限，病害会造成较大程度的损失。DB53/T 9622020 5 A A 附 录 A（规范性附录）选择性培养基的配制 A.1 抗生素母液的配制 分别配制浓缩100倍的抗生素母液。配制时，分别配制原母液，用乙醇溶解多菌灵、恶霉灵和五氯硝基苯，二甲亚砜溶解制霉菌素，甲醇溶解利福平，超纯水溶解氨苄青霉素；使用时，可以将乙醇、甲醇、超纯水配制的原母液混合在一起配成浓缩100倍的混合抗生素使用母液，二甲亚砜配制的母液单独使用，所有抗生素母液均经过0.22 m的微孔滤膜过滤灭菌。A.2 选择性培养基的配制 V8汁200 mL加自来水或蒸馏水至1000 mL，混匀加入（1720）g琼脂粉，121灭菌（1530）min，冷却至（6070）时添加多菌灵（终浓度10 g/mL）、恶霉灵（终浓度50 g/mL）、五氯硝基苯（终浓度25 g/mL）、利福平（终浓度10 g/mL）、氨苄青霉素（终浓度50 g/mL）以及制霉菌素（终浓度25 g/mL）。添加时，先加入混合抗生素母液，再加制霉菌素母液，边加边摇匀，倒平板，即获得选择性培养基。DB53/T 9622020 6 B B 附 录 B（规范性附录）一种 PCR 鉴定方法 B.1 DNA 的快速提取 每土样选取疑似菌落（3050）个，挑取疑似烟草疫霉菌菌落5 mm5 mm的菌丝块，移入装有500 L 真菌裂解液（200 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，200 mmol/LNaCl，1%N-lauroylsarcosine，pH 8.0）的1.5 mL 离心管中，室温下孵育（2030）min 后，4、18000 g离心4 min，吸取300 L 上清液转移到另一支灭过菌的1.5 mL 离心管中，加入750 L 冰冻的无水乙醇，轻轻颠倒几下后，4、18000 g离心2 min，弃去上清液，再用冰冻的75%乙醇洗涤1次，置于室温下干燥后，加入（2030）L 超纯水溶解后，即为DNA 模板溶液。用紫外分光光度计检测DNA 模板溶液的浓度与纯度，稀释到合适的浓度备用。B.2 特异性引物的合成 烟草疫霉菌特异性引物ITS8-1/ITS8-2（5c-CGAAGCCAACCATACCACGAA-3c/5c-ATGAAGA ACGCTGCGAACTGC-3c）由相关生物技术公司合成。B.3 PCR扩增 PCR反应体系（25 L）：Taq DNA聚合酶（0.05 U/L），12.5 L；10PCR缓冲液2.5 L；氯化镁（25mM），1.5 L；脱氧核苷酸混合液，1.5 L；上下游引物各1.0 L；DNA模板，1.0 L；加双蒸水至25.0 L。反应参数：94 预变性 1 min，94 变性 30 s，55 退火 30 s,72 延伸 1 min，30个循环，72 延伸8 min。B.4 PCR 产物的检测 取10 L扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶、0.5TBE 缓冲液中，100 V电压下电泳40 min，100 bp 梯度DNA标准作为分子量参照，溴化乙锭染色，凝胶成像仪中检测，若出现364 bp DNA 特异性基因片段，则可判定为烟草疫霉菌。图B.1 引物 ITS8-1/ITS8-2 扩增出 364 bp 的目标片段 DB53/T 9622020 7 C C 附 录 C（规范性附录）土壤带菌量与病情之间的关系测定 C.1 烟草疫霉菌游动孢子悬浮液 按4.3.2.2的方法计数，稀释制备浓度分别为1.0102 cfu/mL、5.0102 cfu/mL、1.0103 cfu/mL、5.0103 cfu/mL、1.0104 cfu/mL的烟草疫霉菌游动孢子悬浮液。C.2 接种 取苗龄（4555）d、（67）片真叶期感病品种（GB/T 23224测定）的盆栽烟苗，用5 mm打孔器打入5 cm伤根，每株距离根茎（1.52.0）cm 对称打孔2处，每打孔处浇入5 mL游动孢子悬浮液，每浓度梯度处理烟株（2030）株，以不加游动孢子的灭菌水为对照，每处理重复3次。C.3 病情调查 处理后的烟苗放置在（2628）的人工光照培养室内按湿润育苗方法培养，每7 d调查1次发病率，共调查5次，以发病率最高的计测对应浓度梯度的病情。C.4 相关性分析 作游动孢子含量发病率曲线图，采用数据处理软件回归分析。D _ DB53/T 9622020