羊A型产气荚膜梭菌PCR和ELISA检测技术规程DB37／T 4000—2020.pdf

ICS 65.120 B 46 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 4000 2020 羊A 型产 气荚膜梭 菌PCR 和ELISA 检测 技术规程 Technical specification for detection of sheep clostridium perfringens by PCR and ELISA 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4000 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由山 东省 畜牧 兽医 局提出 并组织 实 施。本标准 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口。本标准 主要 起草 单位：山 东农业 大学、山 东省 动物 疫病预 防与 控制 中心。本标准 主要 起草 人：朱瑞 良、魏 凯、闫振 贵、彭军、胡莉 萍、黄河、杨 萍萍、柳洪 洁、曹振 山、王敏、王 世荣、郝 长宝。DB37/T 4000 2020 1 羊 A 型产 气荚膜梭 菌 PCR 和 ELISA 检 测技术 规程 1 范围 本 标准 规定 了 羊A型 产气 荚 膜梭菌PCR 和ELISA 检 测方 法的技 术规 范。本 标准 适用 于 羊A型 产 气荚膜 梭菌PCR 和ELISA 的 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 14925 实验 动物 环 境及设 施 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 一抗 酶联免 疫吸附 试验（ELISA）中用 于与包 被的 抗原结 合的抗 体称为 一抗。阴阳 性血清 和待检 血清 统称为一 抗。3.2 二抗 酶联免 疫吸 附试 验（ELISA）中用 于与 一抗 结合 的 抗 抗 体称为 二抗。本 标准 中兔 抗 羊IgG 抗体 为二 抗。4 试剂或 材料 4.1 产气荚 膜梭 菌 使用A 型产 气荚 膜梭 菌标 准 株CVCC41。4.2 产气荚 膜梭 菌阳 性血 清 羊 经 免 疫 产 气 荚 膜 梭 菌 抗 原3 次 后 获 得 的 血 清，每 次 免 疫 间 隔 两 周。抗 体 中 和 试 验 检 测 效 价 高 于1:256（附 录A）。4.3 阴性血 清 从健康 的未 感染 未免 疫的 羊 分离 的血 清（附录A）。DB37/T 4000 2020 2 4.4 生化试 剂 灭菌0.5%石 炭酸 生理 盐水、PBS、PBST、Tris-HCL、牛血清 白蛋 白（BSA）、底 物反应 液（具体 配制方法见 附录B）；PCR buffer；dNTP；Taq 聚合 酶；溴酚蓝；二 甲苯 青；蔗糖；Tris-乙 酸；乙二 胺四 乙酸（EDTA）；溴 化乙 锭；琼脂糖；Tween-20；考马 斯亮蓝G-250；考马 斯亮 蓝R-250；邻 苯二 胺（OPD）；30%丙烯 酰胺；十二 烷基 硫 酸钠（SDS）；过硫 酸铵（AP）；四甲基 乙二 胺（TEMED）；甲醛溶 液；FT 培养基；产毒 培养 基；酵母 浸膏粉；蛋 白胨；L-精氨 酸；糊 精。4.5 水 试验用水 符合GB/T 6682 三 级水 的 规定。5 仪器设 备 5.1 微量移 液器：量 程 为 20 L100 L。5.2 PCR 管：200 L 体积。5.3 灭菌吸 管：1.0 mL。5.4 恒温培 养箱。5.5 匀速振 荡器。5.6 离心机：转速 不低于 16000 r/min。5.7 96 孔 ELISA 酶 标板。5.8 PCR 仪。5.9 酶标仪：波 长范 围340 nm850 nm。5.10 分光光 度计。5.11 玻璃比 色皿。6 产气荚 膜梭 菌PCR 检 测方 法 6.1 本检测 方法 在200 L 的 离 心管中 进行，所 使用 的引 物如下：表1 产气荚 膜梭 菌 PCR 引 物序 列 Primers Primer sequence(5-3)Size(bp)CPA-F TATGAATGGCAAAGAGGA 589 CPA-R ACTAAAATACTGACCTTC 6.2 所用的 上样 缓冲 液为：质 量/体 积比 为0.25 的溴 酚蓝，质 量/体积 比为0.25%的二 甲苯 青，质 量/体积比 为40%的 蔗糖 水溶 液。6.3 所用的 含溴 化乙 锭的 琼脂 糖凝胶 为 由0.04 M 的 Tris-乙酸 和0.001M 的 乙二 胺 四乙酸（EDTA）组成的TAE 缓 冲液 配制 的，其中 含 0.5 g/mL 的 溴化 乙锭和 质量/体 积比 为1.5%琼脂 糖。6.4 试验步 骤如 下：a)将过夜 培养 的病 原菌，采 用细菌 基因 组 DNA 提 取试 剂盒抽 提细 菌的 基因 组 DNA；b)以上述 细菌 基因 组 DNA 为 模板进 行PCR 扩 增。PCR 扩增反 应体 系（50 L）为：10PCR buffer（含Mg2+）5.0 L、2.5 mmol/L dNTP 4.0 L、Taq 聚合 酶0.3 L、模 板为2.0 L、引 物浓度为 10 pmol/L，用 补齐 至 50 L；DB37/T 4000 2020 3 c)PCR 扩 增反 应条 件为：预 变性 94 7 min；94 变性 30 s、56 退火 30 s、72 延伸45 s，30 个 循环；产 物末 端 72 延伸 10 min；d)PCR 扩 增产 物加 入上 样缓 冲 液后，再 加样 于含0.5 g/mL 溴 化乙 锭的1.5 琼 脂糖凝 胶中，进行琼脂 糖凝 胶电 泳检 测。6.5 结果判 定 紫外成 像仪 下观 察PCR 产 物 凝胶电 泳，如 果出 现589 bp 的目 的条 带（如 图1），则判定 为产 气荚 膜梭菌。图1 PCR 目 的条 带图 示 注：M 代表 DNA Marker；1,2,3,4 代表检测样本。7 ELISA 检测 方法 7.1 包被 包被：将产 气荚 膜梭 菌 毒素蛋 白用 包被 液（0.05 mol/L 碳酸 盐缓 冲液，pH9.6）稀 释成10 g/mL，包被酶 标板。7.2 封闭 用PBST 洗涤 酶标 板5 次。每 孔加入 封闭 液（含1%BSA 的PBS）200 L，置 于湿 盒 内，4 封 闭过 夜。7.3 一抗孵 育 用PBST 洗涤 酶标 板5次。取1孔加 入1:10 倍稀 释羊 抗产 气荚膜 梭菌 毒素 高免 血清 作为阳 性对 照（制备方法 见附录B），取1孔 加入1:10 倍 稀释的 羊阴 性 血清作 为阴性 对照（制备 方法见 附录B）；其 它孔 加1:10稀 释的 待检 血清，置 湿盒内37 作用60 min。抗体稀 释液 为1 BSA 的PBS。7.4 二抗孵 育 用PBST 洗涤酶 标板5 次。加 入1:5000 稀 释的HRP 标记 的 兔抗羊IgG（抗体稀 释液 为1 BSA 的PBS），置湿盒 内37 作 用45 min。7.5 底物显 色 用PBST 洗涤 酶标 板5 次。加 底物反 应液，置 湿盒 内37 避光 显色20 min。DB37/T 4000 2020 4 7.6 读数 最后用2.0 mol/L 的H2SO4 溶 液终止 反应，以 酶标 仪检 测样品 的OD490 值。7.7 结果判 定 以待测 孔的OD值 大于 或等 于阴性 对照 孔的2倍 者，即P/N 大于 或等 于2 判为 阳性，重复3 次计 算平 均值。DB37/T 4000 2020 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）羊产气 荚膜 梭菌 毒 素的 提取和 抗血 清的 制备 A.1 羊产气 荚膜 梭菌 毒 素蛋 白 的提 取 A.1.1 将保存 的羊A 型产气 荚膜 梭 菌标准 株（CVCC41）接种 于200 mL FT 培 养基 中进行 增菌，37 厌 氧培养 12 h。A.1.2 将增菌 液以5%的比 例接种 到产毒 培养基（配 制方 法 见附录A）中，43 厌氧 培 养 5 h-6 h 进行产毒。产毒 结束，离 心（12000 r/min，30 min）取 上清，离心 后用 0.22 m 的滤器 过滤 取上 清。A.1.3 将过饱 和硫 酸铵 溶液 缓慢 加入到 上述 所制 得上 清中，使其 终浓 度达 到40%，4 静置 过夜。A.1.4 离心（10000 r/min，20 min）保 留 沉 淀，用 同体 积 的含2%Triton X-100 的Tris-MgCL2 缓冲 液溶解。A.1.5 溶解完 成后，向管 内加入 过饱和 硫酸铵 溶液 使其终 浓度为40%，再次离 心方 法 同上，最后取 3.0 mL 0.05M 的Tris-HCL 缓冲液（PH=7.5）溶 解沉 淀。A.2 羊产气 荚膜 梭菌 毒 素蛋 白 含量 测定 A.2.1 采用Bradford 方 法，具体 操作步 骤如 下：a)取16 支试 管，1 支作 空白，3 支 留作 未知样 品，其余 试管分 为两 组，分别 加入 样品、水和 试剂，即用 1.0 mg/mL 的标 准蛋 白质溶 液给 各试 管分 别加 入：0 mL、0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然 后用 无离 子水 补充 到 0.1 mL；b)最后各 试管 中分 别加 入 5.0 mL 考马 斯亮 兰 G-250 试 剂，每 加完 一管，立 即在 旋涡混 合器 上 混合（不 能太 剧烈，以 免产 生大量 气泡 而难 于消 除）；c)加完试 剂 2 min-5 min 后，即可 开始 用玻 璃比 色皿，在分 光光 度计 上测 定各 样品 在 595 nm 处的光吸 收值A595，空 白对 照为第 1 号 试管，即 0.1 mL 水加 5.0 mL 考马 斯亮 兰 G-250 试剂。比色皿 使用 后立 即用 少 量95%的 乙醇 荡洗，以 洗去 染 色。塑 料比 色皿 决不 可用 乙醇或 丙酮 长时间浸泡；d)用标准 蛋白 质量（mg）为 横座标，用 吸光 度值 A595 为纵座 标，作图，即 得到 一条标 准曲 线。由此标 准曲 线，根据 测出 的未知 样品 的 A595 值，即 可查出 未知 样品 的蛋 白质 含量。0.5 mg 牛血清蛋 白/mL 溶 液的A595 约为0.50。A.2.2 微量 法：当样品 中蛋 白质 浓度 较稀 时（10 mg/mL-100 mg/mL），可将 取样 量（包括 补加 的水）加大 到0.5 mL或1.0 mL，空 白对 照则分 别为0.5 mL或1.0 mL水，考马斯 亮蓝G-250试 剂仍 加5.0 mL,同 时作相 应的 标准曲线，测 定595 nm 的光 吸收值。0.05 mg 牛 血清 蛋 白/mL 溶液 的A595约为0.29。A.3 羊产气 荚膜 梭菌 毒 素 聚 丙烯酰 胺凝 胶电 泳(SDS-PAGE)检测 A.3.1 聚丙烯 酰胺 凝胶 电泳（SDS-PAGE）采 用解 离非 连续 缓 冲系统 垂 直 板电 泳。A.3.2 使用浓 缩胶 为5%，分 离胶 为12%的不 连续 聚丙 烯酰 胺 凝胶（附录B）。DB37/T 4000 2020 6 A.3.3 电泳结 束，采用 考马 斯亮 蓝R-250 染 色，以标 准低 蛋 白分子 量的 对数 值和 电泳 迁移率 绘制 标准 曲线，求 出各 蛋白 分子 量。A.4 产气荚 膜梭 菌 毒素 抗血 清 的制 备 A.4.1 将甲醛 缓慢 的加 入到 含有 毒素的 溶液 中使 甲醛 终浓 度达到 0.3%，混 匀后，在37条 件下 将外毒素灭 活 96 h，期 间每 隔 5 h-6 h 振荡 一次 混合 液。A.4.2 将灭活 的羊 产气 荚膜 梭菌 毒素蛋 白液 与弗 氏不 完全 佐剂混 合（V:V=1:1），用 漩涡振 荡器 乳化，制备羊 产气 荚膜 梭菌 毒 素 免疫用 抗原。A.4.3 选取15 kg 左右 的健 康未 感 染未免 疫的 羊2 只，肌肉 注 射免疫 毒 素抗 原，共免 疫3次，每次 间隔2周，毒 素免 疫剂 量为10 mg/只/次。饲 养环 境饲 养符 合GB 14925 实验 动物 环 境及设 施 国 家标 准的 要求。A.4.4 最后1 次免 疫后7 d 采 血，抗体中 和试 验检 测血 清中 羊抗羊 产气 荚膜 梭菌 毒 素 抗体的 效价，效价高于1：256 以上 时采 血，分离血 清，-20 保 存备 用。A.5 阴性血 清制 备 采集健 康未 感染 过产 气荚 膜梭菌 的羊，制 备阴 性血 清。DB37/T 4000 2020 7 B B 附 录 B（规范 性附 录）溶液的 配制 B.1 灭菌0.5%石炭 酸生 理盐 水 的配制 称取9.0 g氯 化钠（NaCl）溶于水，定 容到1.0 L，再 加入5.0 mL苯 酚。配制 后 高压灭 菌器 灭菌 后使用。B.2 磷酸盐 缓冲 液（PBS）的 配 制 1 mol/L PBS（pH 7.2）的 配方如下：a)氯化钠（NaCL）：8.0 g；b)氯化钾（KCL）：0.2 g；c)磷酸氢 二钠(Na2HPO4)：1.44 g；d)磷酸二 氢钾(KH2PO4)：0.24 g；e)加水900 mL，调 pH 等于7.2，定 容 至1000 mL。B.3 PBST 缓 冲液 的配 制 1.0 L PBS+1.0 mL Tween-20。B.4 牛血清 白蛋 白（BSA）将100 mg的 牛血 清白 蛋白 加入9.5 mL 水中（须 将蛋 白加入 水中，而 不是 将水 加入蛋 白中），盖 好 盖后，轻 轻摇 动，直至 牛血 清白蛋 白完 全溶 解为 止。加水定 容到10 mL，然后 分 装成小 份，贮存 于-20。B.5 Tris-HcL缓 冲液 的配 制 配方如 下：a)Tris 碱：121.1 g；b)浓盐酸（1mol/L HCl）：42.0 mL；c)水：定容至 1000 mL。在900 mL水 中加 入121.1g Tris 碱，溶液 冷却 至室 温 后调节 溶液pH值至8.0，然 后定容 至1000 mL，分装后 高压 蒸汽 灭菌30 min，室 温保 存。B.6 5%浓缩 胶配 制 配方 如 下：a)水：2.1 mL；b)30%丙 烯酰 胺：0.5 mL；DB37/T 4000 2020 8 c)1.0M Tris-HCL buffer：0.38 mL；d)10%SDS：0.03 mL；e)10%过 硫酸 铵（AP）：0.03 mL；f)TEMED：0.003 mL。B.7 12%分 离胶 配制 配方如 下：a)水：1.65 mL；b)30%丙 烯酰 胺：2.0 mL；c)1.0M Tris-HCL buffer：1.25 mL；d)10%SDS：0.05 mL；e)10%过 硫酸 铵（AP）：0.05 mL；f)TEMED：0.004 mL。B.8 底物反 应液 的配 制 取10 mL 磷 酸盐 柠 檬酸 缓 冲液，加邻 苯二 胺（OPD）4.0 mg 和3 H2O2 15 L。B.9 产毒培 养基 的配 制 称取酵 母浸 膏粉 2.0 g、蛋白胨 2.0 g、L-精 氨酸 1.2 g、糊精 1.0 g加入100 mL PBS 缓冲 液调 节pH为7.4。_