液体菌种制备技术规程　第4部分：灵芝DB37／T 3690.4—2020.pdf

ICS 65.020.20 CCS B 05 山东省地方标准 DB37/T 3690.4 2020 37 液体菌种 制备技术 规程 第4 部分：灵芝 Technical specifications for the preparation of liquid spawn Part 4：Ganoderma lingzhi 2020-12-04 发布 2021-01-01 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 3690.4 2020 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 基 本要 求.2 4.1 工作 人员 卫生 要求.2 4.2 场所 要求.2 4.3 生产 车间 要求.2 5 设 施设 备.2 5.1 基本 设施.2 5.2 基本 设备 与用 具.2 6 生 产技 术.3 6.1 工艺 流程.3 6.2 培养 基.3 6.3 母种 制作.3 6.4 摇瓶 菌种 制作.3 6.5 发酵 罐液 体菌 种制 作.4 7 贮存.6 8 生 产档 案.6 附录A（规 范性）灵芝 液体菌 种生 产记 录事 项.7 DB37/T 3690.4 2020 II 前 言 本文 件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。本文件 是DB37/T 3690 液 体菌种 制备 技术 规程 的 第4部 分。DB37/T 3690 已 经发布 了以 下部 分：第1 部 分：香菇；第2 部 分：黑木 耳；第3 部 分：平菇；第4 部 分：灵芝。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由山 东省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本文件 由山 东省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：山东 省 农业技 术推 广总 站、泰 安 市农业 科学 研究 院、菏 泽 市定陶 区特 色农 产品 服务中心、菏 泽市 定陶 区茗 嘉兴农 作物 种植 专业 合作 社。本文件 主要起 草人：高霞、王庆 武、赵 淑芳、崔晓、高中 强、高 瑞杰、孙振 福、丛 倩倩、马化 彬、李秀梅、司 元明、唐 丽娜、张燕、兰 玉菲、安 秀荣。DB37/T 3690.4 2020 1 液 体菌种 制备技术 规程 第 4 部分：灵芝 1 范围 本文件 规定 了灵 芝液 体菌 种制备 的术 语和 定义、基 本要求、设 施设 备、生产 技术、贮存 和生 产 档 案等技术 要求。本文件 适用 于灵 芝液 体菌 种的制 备。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 150.1 压力 容器 第1 部分：通用 要求 GB 4789.28 食 品微 生物 学检验 培养 基和 试剂 的质 量要求 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB/T 12728 食 用菌 术语 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 NY/T 1742 食 用菌 菌种 通 用技术 要求 3 术语和 定义 GB/T 12728 界定 的术 语和 定义适 用于 本文 件。3.1 食用菌 液体 菌种 发酵 罐 edible mushroom liquid spawn fermenter 进行食 用菌 液体 菌种 培养 的专用 发酵 设备，是利 用 生物发 酵原 理，给 菌丝 生 长提供 最佳 的营 养、酸碱度、温 度、供 氧量 等生 长 条件，使 菌丝 快速 生长，迅 速扩繁，在短 时间 达到 一 定菌球 数量 的专 用容 器。3.2 罐压 jar pressure 在液体 菌种 发酵 制备 过程 中发酵 罐内 保持 的空 气压 力（表 压）。注：单位为MPa。3.3 通气量 ventilation volume 在液体 菌种 培养 过程 中发 酵罐 体 积与 每分 钟通 入发 酵罐中 无菌 空气 体积 的比 例。注：用 V/V（发酵罐体积/通入空气 体积）表示。3.4 接种量 inoculation amount 液体菌 种体 积与 培养 基体 积的比 例。注：用百分数表示。DB37/T 3690.4 2020 2 3.5 液体菌 种菌 龄 period of liquid spawn running 液体菌 种接 入培 养基 开始 计算的 液体 菌种 培养 时间。3.6 发酵罐 空消 empty fermenter sterilization 对尚未 加水 投料 的空 发酵 罐进行 高压 灭菌。3.7 发酵罐 实消 fermenter sterilization 对投料 后的 发酵 罐进 行高 压蒸汽 灭菌。3.8 空气过 滤器 air filter 能对食 用菌 液体 菌种 发酵 罐所用 空气 进行 滤除 杂菌 和其他 杂质，达 到无 菌洁 净要求 的设 备。3.9 摇瓶液 体菌 种 liquid spawn in shake flask 装至玻 璃菌 种瓶 内在 磁力 搅拌器 或恒 温摇 床上 培养 的液体 菌种。3.10 终止 pH initial pH value of medium 液体菌 种达 到放 灌指 标时 的培养 基pH。4 基本要 求 4.1 工作人 员卫 生要 求 工作人 员应保 持个 人卫生，进生 产车间 前须 洗手、消毒，应穿戴 经消 毒处理 的工作 服、口 罩、鞋、帽等。4.2 场所要 求 应符合NY/T 528 的环 境卫 生要求，场 地开 阔、路面 硬化。4.3 生产车 间要 求 4.3.1 厂房设 置和 布局 应符 合 NY/T 528 的 要求，增 设摇 瓶 菌种培 养室、发 酵罐 菌种 培养室。4.3.2 车间设 计应 符 合GB 50073 的要求。车 间地 面应 能防 水、防渗漏、防 滑、防腐 蚀、易清洗，排 水通畅；墙壁 和天 花板 应能 防潮、防霉、防 水、易清 洗。4.3.3 车间内 设有 更衣 室、洗手、消毒 和干 手设 施，安装 换气设 备。过道 应设 置风 淋室。4.3.4 车间设 封闭 式废 物桶。5 设施设 备 5.1 基本设 施 培养基 配制 室、摇瓶 菌种 培养室、发 酵罐 菌种 培养 室规模 要配 套，布局 合理，摇瓶 菌种 培养 室、发酵罐菌 种培 养室 要有 调温 设施，其中 培养 基配 制室 空间洁 净度 应达 到万 级以 上。菌 种检 验室 和 母 种 制 作室要有 相应 的实 验检 测设 备和制 种用 的灭 菌设 施。5.2 基本设 备与 用具 DB37/T 3690.4 2020 3 液体菌 种发 酵罐、空 气压 缩机、高压 蒸汽 灭菌 锅、恒温摇 床或 磁力 搅拌 器、超净工 作台、摇 瓶（或三角烧 瓶）、显微 镜、电子 秤等设 备及 常规 用具。其 中液体 菌种 发酵 罐、高 压 蒸汽灭 菌 锅 应符 合GB 150.1的要求，并 经有 关部 门检 验合格。应 具有 备用 电源。6 生产技 术 6.1 工艺流 程 工艺流 程见 图1。图1 灵芝液 体菌 种生 产工 艺流 程 6.2 培养基 6.2.1 母种培 养基 马铃薯200 g/L（去皮 煮汁）、麦麸40 g/L（煮 汁）、葡 萄糖20 g/L、蛋白 胨3 g/L、磷酸二 氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、琼 脂20 g/L，pH 自然。6.2.2 液体菌 种培 养基 6.2.2.1 摇瓶菌 种培 养基 葡萄糖20 g/L、蛋 白胨3 g/L、牛肉 膏3 g/L、磷酸二 氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、维生 素B1 5 mg/L，pH自然。6.2.2.2 发酵菌 种培 养基 宜选用 以下 配方，且 生产 用水应 符合GB 5749 的要 求：a)配方1：葡萄 糖20 g/L、蛋 白胨3 g/L、磷酸 二氢 钾 1 g/L、硫 酸镁0.5 g/L、维 生 素B1 5 mg/L、消泡 剂0.3 g/L，pH 自然；b)配方 2：玉米粉 15 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵 母粉 2 g/L、磷 酸二 氢钾 2 g/L、硫 酸镁 1 g/L、消泡剂0.3 g/L，pH 自 然；c)配方 3：淀粉 10 g/L、玉 米粉 10 g/L、牛肉 膏 3 g/L、蛋白 胨 3 g/L、磷酸 二氢 钾 2 g/L、硫 酸镁1 g/L、消泡 剂 0.3 g/L，pH 自然。6.3 母种制 作 母种制 作应 符合NY/T 528 的要求，母 种质 量应 符合NY/T 1742 的 要求。6.4 摇瓶菌 种制 作 DB37/T 3690.4 2020 4 6.4.1 培养基 配制 按液体 培养 基配 方，称取 原料，加水 搅拌 至完 全溶 解，定 容。6.4.2 装瓶灭 菌 将液体 培养基 装入 摇瓶中，装液 量为摇 瓶容 量的50%60%，聚 丙烯薄 膜或 瓶 塞封口。高压 蒸汽 灭菌，0.11 MPa 0.13 MPa 恒 压维持20 min 30 min。6.4.3 接种培 养 液 体培 养基 冷却 至室 温，无 菌条 件下，挑 取78块（2 3）mm（2 3）mm的 母种 菌块 接入 摇瓶内，避光 静置24 h 后置 于恒 温摇床 或磁 力搅 拌器 上，25 28、140 r/min 160 r/min，培养4 d 6 d。6.4.4 摇瓶菌 种要 求 菌种外 观澄 清透 明不 浑浊，无杂 菌、无异 味；菌丝 体密集、均 匀悬 浮于 液体 中不分 层，菌丝 体 湿 重不少于50 mg/mL。6.5 发酵罐 液体 菌种 制作 6.5.1 发酵罐 空消 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期置放、更换品种等情况出现其一时，应进行空消。蒸汽压力 0.14 MPa维持40 min。6.5.2 培养基 配制 按液体 培养 基配 方，称取 原料，加水 搅拌 至完 全溶 解，定 容。6.5.3 上罐 打开罐 盖，将 液体 培养 基加 入罐内，装液 量为 发酵 罐容 量的70%80%。通入 空气 搅拌1 min 2 min，混合均 匀，密封 盖口。6.5.4 发酵罐 实消 发酵罐 夹套 注入 清水，水 位低于 排水 口20 cm，开 启 加热棒 电源，待夹 套压 力 达到0.05 MPa 时 缓慢 打开排气阀降压至0 MPa，关 闭 排 气 阀 继 续 升 压 至0.13 MPa 0.14 MPa；同 时，待 发 酵 罐 罐 内 压 力 达 到 0.05 MPa 时缓 慢打 开排气 阀降压 至0 MPa，关 闭排气 阀继续 升压至0.11 MPa 0.12 MPa，微 开排气 阀和 气调器，同时 打开 空气 过滤 器，维 持灭 菌50 min 60 min。6.5.5 冷却 灭菌结 束，关闭加热棒 电源、空 气过滤器灭菌阀 门，缓慢 打开夹套排气阀 降压至0 MPa，立即注入冷水降 温；同时 缓慢 打开 罐内排 气阀 降压，待 压力 接近0.05 MPa 时 通入 无菌 空气，关闭 排气 阀，并用75%酒精棉 球封 堵排 气阀 阀口，调 节气 调器维 持罐 压0.03 MPa 0.05 MPa，待 液体 培养基 降温 至28，关 闭夹套进 水阀 停止 冷却。6.5.6 接种 DB37/T 3690.4 2020 5 接种口 用95%酒 精棉 球擦 拭灼烧，在火焰 圈保 护下，去 掉摇 瓶接种 管上 的保 护物，将 接种管 套 在 接种口上，撤 掉火 焰圈，调 节气调 器，将罐 压降 至0.01 MPa，打开 接种 口阀 门注 入摇瓶 菌种，接 种量 为发酵罐装 液量 的0.5%1.0%，关闭 接种 口，塞上75%酒精棉 球，继续 通入 无菌 空气。6.5.7 发酵培 养 根据菌 丝生 长情 况，适时 调节进 气量，通 入适 量无 菌空气，通 气量 为1：0.8 1：1；同时 调节 气调器，维 持罐 压0.02 MPa 0.03 MPa，培养 温度25 28，培 养5 d 7 d。6.5.8 发酵罐 液体 菌种 质量 要求 6.5.8.1 感官要 求 感官指 标要 求应 符合 表1 的 规定。表1 发酵罐 液体 菌种 感官 要求 项 目 要 求 菌液色泽 菌丝体呈白色，滤液呈淡黄色 菌液气味 有灵芝液体菌种培养时特有的气味，无异味 菌液形态 菌液澄清透明不浑浊，稍粘稠；菌丝体密集、均匀悬浮于液体中不分层 菌种微观 菌丝粗壮、分枝密度高、有隔膜，可见锁状联合，无杂菌 6.5.8.2 理化性 状 理化指 标应 符合 表2 的规 定。表2 发酵罐 液体 菌种 理化 指标 项 目 要 求 终止pH 3.6 5.5 菌丝体湿重（mg/mL）50 6.5.9 液体菌 种检 测 6.5.9.1 形态学 观察 通过肉 眼及 显微 镜观 察菌 丝体形 态。6.5.9.2 霉菌检 验 无菌条 件下 从取 样口 取少 量菌液，接种于GB 4789.28 中规定 的PDA 培 养基 中，置 于28 30 恒温培养48 h，采用 显微 镜和 感官观 察菌 丝生 长状 况和 有无霉 菌污 染，必要 时进 行水封 片镜 检。6.5.9.3 细菌检 验 无菌条 件下 从取 样口 取少 量菌液，接 种于GB 4789.28 中规定 的营 养肉 汤培 养基 中，置 于30 37 恒温培 养24 h48 h，观 察 是否有 细菌 污染，必 要时 进行镜 检和 划线 培养 检验。DB37/T 3690.4 2020 6 6.5.9.4 pH 测定 取样用pH计或pH 试纸 测定 菌液酸 碱度。6.5.9.5 菌丝体 湿重 测定 取一定 体积 的样 品，经10 000 r/min 离心5 min，称 其 湿重。7 贮存 液体菌 种生 产后 应及 时使 用。如不 能及时 使用，发 酵罐内 需持 续通 无菌 空气，保 持罐 压0.02 MPa 0.03 MPa，常温 下贮 存时 间不超 过2 d。8 生产档 案 母种、摇瓶 液体 菌种 和发 酵罐液 体菌 种生 产中 的每 个环节 由操 作技 术人 员现 场详细 记录，记 录 内 容应按附 录A 执行，签 字后 归 档保存。档 案应 保存 至本 批次液 体菌 种栽 培出 第一 潮芝。DB37/T 3690.4 2020 7 附录A（规范 性）灵芝液 体菌 种生 产记 录事 项 灵芝液 体菌 种生 产记 录事 项如下：a)生产投 入品 使用 情况（包 括液体 菌种 的制 作培 养基 质、营 养辅 料、所用 菌种、菌瓶）：1)名称；2)来源；3)用法、用量；4)使用、停用 的日 期。b)菌种生 产（培养 基制 作、灭菌、冷却、接 种、培养）及杂 菌发 生情 况：1)培养基 制作；2)高压灭 菌；3)冷却；4)接种；5)培养。c)贮存过 程及 杂菌 发生 情况；d)主要菌 种生 产设 备及 用具：1)主要菌 种生 产设 备；2)主要菌 种生 产用 具。e)生产场 所名 称、菌种 数量、记录 人、入档 日期。