药用植物繁殖体超低温保存技术指南DB45／T 1665-2018.pdf

ICS 65.0 20.20 B 38 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB45/T 16652018 药用植物繁殖体超低温保存技术指南 Techinical guide of medi cinal plants propagule cryopreservation 2018-01-20 发布 2018-02-20 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发布 DB 45/T 1 66 5 20 18 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 基本原则.2 5 基本程序.2 6 材料准备.2 7 冷冻前处 理.3 8 冷冻.3 9 生活力检 测.4 DB 45/T 1 66 5 20 18 II DB 45/T 1 66 5 20 18 III 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。本标准由广西卫生标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区药用植物园。本标准主要起草人：缪剑华、韦坤华、朱艳霞、李翠、林杨、黄燕芬、李林轩、谷筱玉、董扬。DB 45/T 1 66 5 20 18 1 药用植物繁殖体超低温保存技术指南 1 范围 本标准规定了药用植物繁殖体超低温保存技术的术语和定义、基本原则、基本程序、材料准备、冷 冻前处理、冷冻和生活力检测。本标准适用于广西境内药用植物繁殖体的超低温保存。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5 45 8 液氮生物容器 GJ B 22 53 A 氮气和液氮安全应用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 药用植物繁殖体 ve ge tat iv e fo rm of m ed ic in al pl an ts 能通过有性繁殖或无性繁殖方式能繁衍产生药用植物后代的材料，包括有性繁殖体种子、孢子体、花粉等，无性繁殖体根、休眠芽、茎尖分生组织、悬浮细胞、愈伤组织、原生质体等。3.2 超低温保存 c ry op re se rva ti on 在液氮液相（-1 96）或液氮雾相（-1 50）中对生物器官、组织或细胞等材料进行长期保存。在 适宜条件下解冻可恢复活力，繁殖、再生出新的植株，并保持原遗传特性。3.3 冷冻保护剂 c ry op ro te cta nt 可以保护生物器官、组织或细胞等材料免受冷冻损伤的物质，常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜、蔗 糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘油、聚乙二醇等。3.4 玻璃化法 vit ri fi ca ti on 在超低温保存过程中，利用高浓度的冷冻保护剂处理生物器官、组织或细胞，使液态材料在降温过 程中逐渐变成高度粘滞状的、似玻璃状的、非晶体固体状态的方法。DB 45/T 1 66 5 20 18 2 3.5 生活力 vi abi li ty 繁殖体 潜 在的繁殖能力和其所 具 有的生 命 力，即一批 繁殖体中 具 有生 命 力的（即 活的）繁殖体 数目 占总数 的 百 分 率。4 基本原则 4.1 本标准 为 药用植物繁殖体超低温保存通用技术，具 体的 某一 种药用植物或 某一类 繁殖体材料在进 行超低温保存 之 前，都 应进行 试验研究，并 制 定出相应的 操作 处理程序 手册。4.2 超低温保存过程中液氮的质 量 检 验 按 G JB 2 25 3A 的 规 定 执 行。4.3 超低温保存过程中液氮生物容器的技术要 求 和检 验 规 格 按 G B/T 54 58 的 规定 执 行。5 基本程序 5.1 可 直接 冷冻的繁殖体超低温保存 时 应 遵循 的 操作流 程 参见图 1。5.2 需 包 埋预 处理的繁殖体超低温保存 时 应 遵循 的 操作流 程 参见图 2。图1 药用植物繁殖体直接超低温保存技术流程图 图2 药用植物繁殖体包埋法超低温保存技术流程图 6 材料准备 6.1 采集 宜在 晴天上午 9 10 点，选择健 壮、无 病虫危害 的繁殖体。DB 45/T 1 66 5 20 18 3 6.2 记录 每份 繁殖体材料记录品种、采集编号、采集地点、采集时间、采集 人等，建立信息档案。6.3 预处理 将采回 的繁殖体 清水清洗去除表面污垢，装 进 1.8 mL聚乙烯冷冻管 中，冰水浴 条件下加入预冷 至 0 的冷冻保护剂，保护剂的量 以 淹没 繁殖体 为 宜，在0 冰浴 中处理60 min。7 冷冻前处理 7.1 干燥 7.1.1 直接 干燥 方法 主要应用于种子、合子胚、顽拗型种子和中间型种子离体胚轴等繁殖体的超低温保存。一般放置在 15、相对湿 度1 5 的 干燥环境中 脱水，或与 变 色硅胶、无 水氯化 钙 混合快速脱 水。正 常 型 种子可以脱水至含水量510，耐超干种子含水量可低于5。7.1.2 包埋干燥法 主要应用于珠芽、茎尖、悬浮细胞和体细胞胚等繁殖体的超低温保存。将繁殖体用海藻酸盐包埋成 球后，在加有冷冻保护剂的营养培养基中预培养一定时间，再置于流动的无菌空气流或硅胶中进行脱水，使含水量降至20左右（以鲜重为基础）。7.1.3 预培养干燥法 主要应用于根茎、鳞茎、块茎、珠芽、枝条、愈伤组织等繁殖体的超低温保存。将繁殖体在加有冷 冻保护剂的 营养培养 基中 预培养一定 时间，然 后在 无 菌空 气 流 或 硅胶 中进行 干燥脱水，使 含水量降 至 20 左右（以 鲜重为基础）。7.2 玻璃化法 7.2.1 直接玻璃化法 将繁殖体材料用高浓度冷冻保护剂进行脱水处理后直接投入液氮，使材料连同保护剂发生玻璃化转 变，进入玻璃态。7.2.2 包埋玻璃化法 将包埋脱水法和直接玻璃化法相结合。繁殖体首先用藻酸盐包埋成球，然后用玻璃化溶液进行脱水 处理。8 冷冻 8.1 降温冷冻 用移液管吸去经过冷冻前处理的繁殖体中的冷冻保护剂，将材料置于冻存管中，加入新的冷冻保护 剂，拧紧盖子，将冷冻管装入程序降温盒（降温速度约为1/mi n），放置在-80 超低温冰箱内，过夜后取出冷冻管并迅速投入液氮中进行冷冻。DB 45/T 1 66 5 20 18 4 8.2 超低温冷冻 将经 过降温冷冻处理后的材料 投入 液氮 蒸汽 相(-1 50-18 0)或液态 氮(-1 96)中。一般 种 子 贮藏 在液氮 蒸汽 相中，其 他 繁殖材料 贮藏 在液态氮中。9 生活力检测 9.1 初始生活力检测 9.1.1 检测时间 超低温保存1 d 7 d，解冻 一个管，检测其 初始 生活力，以 估 计保存 样品 的 预 期恢复 率 并 确 定保存数量。如果初始 活力高于30，则 可进行液氮超低温长期保存，否 则 需重 新 选择 材料保存。9.1.2 解冻方法 在38 40 水浴 条件下 快速 解冻，待 冻存 管 内的 冰融 化后，用 移 液器 吸去 冷冻保护剂，取 出冷冻保存材料。9.1.3 检测方法 根 据 繁殖体 类型 的不 同 可 选择 活细胞 染色法、细胞和亚细胞 结构 超 显微观察法、发 芽 率 测定 法 等 方 法 检测生活力。9.2 保存期内生活力检测 9.2.1 解冻方法 同 9.1.2。9.2.2 检测方法 同 9.1.3。中华人民共和国广西地方标准 药用植物繁殖体超低温保存技术指南 DB45/T 1665 2018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究