水质　粪大肠菌群测定　光度法DB37／T 3787-2019.pdf

ICS 13.060 Z 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 3787 2019 水质 粪 大肠菌群 测定 光 度法 Water quality determination of fecal coliforms photometric method 2019-12-24 发布 2020-01-24 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3787 2019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 分 光光 度法.1 5 荧 光法.4 DB37/T 3787 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 生态 环境 厅提出 并组 织实 施。本标准 由山 东省 环保 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：山东 省 生态环 境监 测中 心、青 岛 佳明测 控科 技股 份有 限公 司、北京 华夏 科创 仪 器 股份有 限公 司。本标准 主要 起草 人：李恒 庆、由 希华、宗 雪梅、王 婷、王 聪、郑琳 琳、邹康、潘光、周 成、张 芳、张爱芳。DB37/T 3787 2019 1 水质 粪 大肠菌群 测定 光度法 1 范围 本标准 规定 了测 定水 中粪 大肠菌 群的 分光 光度 法和 荧光法。本标准 适用 于地 表水、生 活污水 和工 业废 水中 粪大 肠菌群 的应 急现 场快 速测 定。本方法 的检 出限 为30 MPN/L，检 测范 围：30 109 MPN/L，检测 周期 不大 于18 h。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 14581 水质 湖泊 和水库 采样 技术 指导 HJ/T 91 地表 水 和 污水 监 测技术 规范 HJ 494 水质 采样 技术 指导 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 粪大肠 菌群 fecal coliforms 44.5 培 养能 发酵 乳糖 产 酸产气 的需 氧及 兼性 厌氧 革兰氏 阴性 无芽 孢杆 菌。3.2 最大可 能数 most probable number，MPN 最大可 能数（most probable number，缩写 为MPN），又称 稀释培 养计数，是 一种基 于泊松 分布 的间接计 数法。利用 统计 学 原理，根 据一 定体 积不 同 稀释度 样品 经培 养后 产生 的目标 微生 物阳 性数，查 表估算一 定体 积样 品中 目标 微生物 存在 的 数 量（单位 体积存 在目 标微 生物 的最 大可能 数）。4 分光光 度法 4.1 方法原 理 一定量 的水 样与 选择 性培 养基混 合均 匀放 置于44.5 环境 下，粪大 肠菌 群产 生-半乳 糖苷 酶（-D-galactosidase），并 分 解色原 底物 释放 出色 原体 使培养 基呈 现颜 色变 化，通过连 续分 光光 度（波长：300 nm 600 nm）测 定，依 据待测 水样 色度 变化 与水 中粪大 肠菌 群数 成一 定关 系的原 理，得出 粪大 肠 菌群浓度。4.2 干扰和 消除 DB37/T 3787 2019 2 4.2.1 活性氯 具有 氧化 性，能破 坏微生 物细 胞内 的酶 活性，导致 细胞 死亡，可 在样 品采集（4.5.1）时加入硫 代硫 酸钠 溶液（4.3.4）消 除干 扰。4.2.2 重金属 离子 具有 细胞 毒性，能破坏 微生 物细 胞内 的酶 活性，导致 细胞 死亡，可 在 样品采 集（4.5.1）时加入 乙二 胺四 乙酸 二钠 溶液（4.3.5）消除 干扰。4.3 试剂和 材料 除非另 有说 明，分析 时均 使用符 合国 家标 准的 分析 纯试剂。4.3.1 粪大肠 菌群 检测 试剂 主要 成分：蛋白胨：5 g；硫酸锰：0.005 g；硫酸镁：0.001 g；硫酸锌：0.001 g；磷酸盐：1.78 g；两性霉 素B：0.60 g；蒸馏 水1 000 mL。制法：上述试 剂溶于 蒸馏 水中，充分混 匀，调整pH 值为7.2 7.4，68.95 kPa(115)，高 压灭 菌20 min，分 装贮 存于4 避光备 用。注：也可采用市售商品化培养基制品。4.3.2 硫代硫 酸钠（Na2S2O3 5H2O）。4.3.3 乙二胺 四乙 酸二 钠（C10H14N2O8Na2 2H2O）。4.3.4 硫代硫 酸钠 溶液：（Na2S2O3）=0.10 g/mL，称取 15.7 g 硫代 硫酸 钠（4.3.2），溶 于适 量水中，定 容 至100 mL，临 用 现配。4.3.5 乙二胺 四乙 酸二 钠（EDTA-Na2）溶液：（C10H14N2O8Na2 2H2O）=0.15 g/mL，称 取 15 g 乙二 胺四乙酸二 钠（4.3.3），溶 于 适量水 中，定容 至 100 mL，此溶 液保 质期 为 30 d。4.3.6 无菌水：取 适量 纯水，经121 高压 蒸汽 灭 菌 20 min，备 用。4.4 仪器和 设备 4.4.1 采样瓶：具 螺旋 帽或 磨口 塞的 100 mL、250 mL、500 mL 广口 玻璃 瓶。注：在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。4.4.2 微生物 快速 检测 仪：恒温培 养单 元：不少 于 2 个温控 系统，温 度控 制精 度 1，可自 动调 节待 检 测样本 培养 温度（44.5 1）；检测单 元：不少 于 4 个独 立的检 测系 统，可实 现多 个样本 的同 时监 测；数据显 示、处理 单元：自 动输出 检测 结 果，可 查询 和显示 历史 数据。4.4.3 高压蒸 汽灭 菌器：121 可调、101.3 kpa。4.4.4 量筒：50 mL、100 mL。4.4.5 移液管：1 mL、10 mL。4.4.6 天平：感 量0.01 g。注：移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎，121 高压蒸汽灭 菌20 min，烘干，备用。4.5 样品 4.5.1 样品采 集 DB37/T 3787 2019 3 点位布 设及 采样 频次 按照GB/T 14581、HJ 494 和HJ/T 91 的 相关 规定 执行。与其它 项目一 同采 样时，先单独 采集微 生物 样品，采样瓶（4.4.1）不得用 水 样洗涤，采集 水样 于灭菌的 采样 瓶中。采集河 流、湖 库 等地 表水 样 时，可 握住 瓶子 下部 直接 将 带塞采 样瓶 插入 水中，约 距 水面10 cm 15 cm处，瓶 口朝 水流 方向，拔玻 璃塞，使水 样灌 入瓶 内然 后盖上 瓶塞，将 采样 瓶从 水中取 出。如果 没有 水流，可握住 瓶子 水平 往前 推。采样量 一般 为采 样瓶 容量 的80%左右。采 好水 样后，迅速扎 上无 菌包 装纸。采集地 表水、废 水样 品及 一定深 度的 水样 时，可使 用灭菌 过后 专用 采样 装置 采样。在同一 采样 点进 行分 层采 样时，应自 上而 下进 行，避免不 同层 次的 搅扰。如果采 集的是 含有 活性氯 的样品 时，需 在采 样瓶灭 菌前加 入硫代 硫酸 钠溶液（4.3.4），以除 去 活性氯对 细菌 的 抑 制作 用(每125 mL 容积 加入0.1 mL 的 硫 代硫酸 钠溶 液)；如 果采 集 的是重 金属 离子 含量 较高的样 品，则在 采样 瓶灭 菌前加 入乙 二胺 四乙 酸二 钠（EDTA-Na2）溶 液（4.3.5），以 消除 干扰（每125 mL容积 加入0.3 mL 的 乙二 胺四乙 酸二 钠溶 液）。注：15.7 mg 硫代硫酸钠(4.3.2)可 去除样品中1.5 mg 活性氯，硫 代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。4.5.2 样品保 存 采样后 应在2 h 内检 测，否 则，应10 以下冷 藏但 不 得超过6 h。实验室 接样 后，不能 立即开 展检测的，将样 品于4 以下 冷藏并 在2 h内检 测。4.6 分析步 聚 4.6.1 接种 接种待 测水 样于 装有5 mL 培养基 的检 测瓶 中，定容 至20 mL，水样 与培 养基 应 充分混 匀。4.6.2 培养 打开仪 器电 源开 关，待仪 器 稳定30 min 后，将 接种 后 的检测 瓶放 置于 微生 物快 速检测 仪中，按 照 仪器说明 书进 行操 作，设置 检测温 度为44.5，点 击“检测”按 钮，218 小 时，仪器 自动 培养 得出 结果。4.6.3 对照试 验 4.6.3.1 空白对 照 采用无 菌水（4.3.6）作 为 待测水 样按照 本标 准4.6.1 4.6.2 进行 空白测 定，测 试结果 不得检 出，否则该 次样 品测 定结 果无 效，应 重新 测定 空 白 以及 待测样 品。4.6.3.2 阴性及 阳性 对照 粪大肠 菌群 的阴 性、阳性 菌株参 考表1。表1 阴性、阳性 菌株 参照 表 检测指标 阳性菌种 阴性菌种 粪大肠菌群 大肠埃希氏 菌（耐热型）、克雷 伯氏菌 属(Klebsiella trevisan)（耐热 型）产气肠杆菌、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、假单胞菌属 将标准 菌株 制成300 3 000 个/mL 的菌 悬液，将 菌悬 液按接 种（4.6.1）和培 养（4.6.2）要求 操作，阳性菌 株应 呈现 阳性 反应；阴性 菌株 呈现 阴性 反应，否则，该 次样 品测 定结 果无效，应 重新 测定。注：可 先 制 备 较 高 浓 度 菌 悬 液，采 用 血 球 计 数 器 在 显 微 镜 下 对 其 浓 度 进 行 初 步 测 定，再 根 据 实 际 情 况 用 无 菌 水(4.3.6)稀释至300 MPN/mL 3 000 MPN/mL。DB37/T 3787 2019 4 4.7 结果计 算与 表示 微生物 快速 检测 仪自 动计 算检测 结果，结 果以 科学 计数方 法表 示。4.8 精密度 和准 确度 微生物 检测 数据 为偏 态分 布，按 其统 计分 析要 求，其检测 所得 结果 全部 经对 数（以10为 底）转 换 后进行以 下分 析。4.8.1 精密度 6家实 验室 对粪 大肠 菌群 有 证标准 样品（7 620 MPN/L）进行 测定：实验室 内相 对标 准偏 差为1.92%4.77%，实验 室间 相对标 准偏 差为3.98%，重复性 限为0.32，再现性限 为0.52。6家实 验室 对3个 不同 浓度 实际样 品（浓度 为107 MPN/L、105 MPN/L、103 MPN/L）进行 测定：实验室 内的 相对 标准 偏差 范围分 别为：0.64%2.36%、1.07%3.06%、2.42%6.81%，实 验室间的 相对 标准 偏差 分别 为：0.91%、0.89%、2.64%，重 复性 限为0.34、0.35、0.49，再现 性限 为0.36、0.35、0.52。4.8.2 准确度 6家实 验室 分别 对有 证标 准 菌株（所使 用的 标准 菌株 浓度为7 620 MPN/L）进 行 测定，相对 误差 为：-8.24%1.43%，相对 误 差的最 终值 为：-3.56%7.82%。4.9 质量保 证和 质量 控制 4.9.1 每批样 品按 对照 试验（4.6.3）进 行空 白对 照测 定，定期使 用有 证标 准菌 株进 行阳性、阴 性对 照试验。4.9.2 每批次 实验 取待 测水 样数 量的 10%，做 双样 分析，检测结 果以 双样 平均 值计。4.9.3 对每批 次培 养基 应使 用有 证标准 菌株 进行 培养 基质 量检验。4.9.4 按有证 标准 菌株 保存 条件 的要求，严 格控 制质 量。4.10 废弃物 的处 理 实验产 生的 废弃 物经121 高压 蒸汽 灭菌20 min 后，作为 一般 废物 处理。5 荧光法 5.1 方法原 理 一定量 的水 样与 选择 性培 养基混 合均 匀放 置于44.5 环境 下，粪大 肠菌 群产 生-半乳 糖苷 酶（-D-galactosidase），并 分解-半乳糖 苷释 放出荧 光。疏 水的荧 光产 物聚合 至光学 检测区，通 过光 度计（波 长：350 nm 650 nm）测定，依 据荧 光强 度与 水中粪 大肠 菌群 数成 一定 关系的 原理，从 而得 出 粪大肠菌 群浓 度。5.2 干扰和 消除 按本标 准4.2 条 进行。5.3 试剂和 材料 DB37/T 3787 2019 5 除非另 有说 明，分析 时均 使用符 合国 家标 准的 分析 纯试剂。5.3.1 粪大肠 菌群 检测 试剂 主要 成分：聚合氨 基 酸1.3 g；氯化 钠0.34 g；磷酸 盐0.36 g。制法：聚合氨 基酸、氯化 钠和磷 酸盐，3种 固体 粉末 至于容 器中 充 分 混匀，115 高 压灭 菌20 min，贮存于4 避光 备用。注：也可采用市售商品化培养基制品。5.3.2 硫代硫 酸钠（Na2S2O3 5H2O）。5.3.3 乙二胺 四乙 酸二 钠（C10H14N2O8Na2 2H2O）。5.3.4 硫代硫 酸钠 溶液：同 4.3.4。5.3.5 乙二胺 四乙 酸二 钠（EDTA-Na2）溶液：同4.3.5。5.3.6 无菌水：同4.3.6。5.4 仪器和 设备 按本标 准4.4 条 进行。5.5 样品 5.5.1 样品采 集 按本标 准4.5.1 进行。5.5.2 样品保 存 按本标 准4.5.2 进行。5.6 分析步 聚 5.6.1 接种 接种待 测水 样于 装有2 g 培 养基的 检测 瓶中，定 容至100 mL，水 样与 培养 基应 充 分混匀。5.6.2 培养 打开仪 器电 源开 关，待仪 器 稳定30 min 后，将 接种 后 的检测 瓶放 置于 微生 物快 速检测 仪中，按 照 仪器说明 书进 行操 作，设置 检测温 度为44.5，点 击“检测”按 钮，218 小 时，仪器 自动 培养 得出 结果。5.6.3 对照试 验 5.6.3.1 空白对 照 采用无 菌水（5.3.6）作 为 待测水 样按照 步骤5.6.1 5.6.2 进行空 白测定，测 试 结果不 得检出，否则该次 样品 测定 结果 无效，应重 新测 定空 白以 及待 测样品。5.6.3.2 阴性及 阳性 对照 按本标 准4.6.3.2 进 行。5.7 结果计 算与 表示 DB37/T 3787 2019 6 微生物 快速 检测 仪自 动计 算检测 结果，结 果以 科 学 计数方 法表 示，保留 三位 有效数 字。5.8 精密度 和准 确度 微生物 检测 数据 为偏 态分 布，按 其统 计分 析要 求，其检测 所得 结果 全部 经对 数（以10为 底）转 换 后进行以 下分 析。5.8.1 精密度 6家 实 验室 对粪 大肠 菌群 有 证标准 样品（6 530 MPN/L）进行 测定：实验室 内相 对标 准偏 差为2.32%4.15%，实验 室间 相对标 准偏 差为1.84%，重复性 限为0.36，再现性限 为0.38。6家实 验室 对3个 不同 浓度 实际样 品（浓度 为107 MPN/L、105 MPN/L、103 MPN/L）进行 测定：实验室 内的 相对 标准 偏差 范围分 别为：1.30%3.93%、1.94%4.72%、1.88%4.54%，实 验室间的 相对 标准 偏差 分别 为：1.14%、1.59%、1.72%，重 复性 限为0.55、0.51、0.35，再现 性限 为0.56、0.53、0.36。5.8.2 准确度 6家实 验室 分别 对有 证标 准 菌株（所使 用的 标准 菌株 浓度为6 530 MPN/L）进 行 测定，相对 误差 为：-2.75%1.71%，相对 误 差的最 终值 为：-0.48%3.68%。5.9 质量保 证和 质量 控制 5.9.1 每批样 品按 对照 试验（5.6.3）进 行空 白对 照测 定，定期使 用有 证标 准 菌 株进 行阳性、阴 性对 照试验。5.9.2 每批次 实验 取待 测水 样数 量的 10%，做 双样 分析，检测结 果以 双样 平均 值计。5.9.3 对每批 次培 养基 应使 用有 证标准 菌株 进行 培养 基质 量检验。5.9.4 按有证 标准 菌株 保存 条件 的要求，严 格控 制质 量。5.10 废弃物 的处 理 按本标 准4.10 进 行。_