饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测DB21／T 3278—2020.pdf

ICS 65.120 B 20 备案号：73359-2020 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3278 2020 饲用微 生物制剂 中凝结芽 孢杆菌的 检测 Method for determination of Bacillus coagulans infeeds 2020-07-30 发布 2020-08-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/T 3278 2020 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 培养基和材料.1 4 主要仪器设备和玻璃器皿.1 5 检验程序.2 6 采样.3 7 试样的制备.3 8 试验步骤.3 9 结果与报告.5 附录A（规范性附录）培养基和试剂.7 DB21/T 3278 2020 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则编写。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本标准起草单位：大连三仪动物药品有限公司、江苏三仪生物工程有限公司、大连工业大学、开原市检验检测认证服务中心。本标准主要起草人：江国托、刘艳、单春乔、李娟、林洋、王效禹、刘秋晨、马大川、钱方、牟光庆、刘恩、翟宏旭、曹艳子、顾艳丽、张英雪、杨乔乔、李晶晶、陆继爽、刘星、冷寒冰、曾楠。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862 标准起草单位通讯地址：辽宁省大连市甘井子区营城子镇营旭路9号，联系电话：0411-66886298DB21/T 3278 2020 1 饲 用微生 物制剂中 凝结芽 孢杆菌的 检测 1 范围 本标准规定了饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测方法。本标准适用于含有益微生物凝结芽孢杆菌的各种饲料添加剂中凝结芽孢杆菌的检测。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008/ISO 3696：1987，MOD）GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 14699.1 饲料采样（GB/T 14699.1-2005/ISO 6497：2002，IDT）GB/T 20195 动物饲料 试样的制备（GB/T 20195-2006/ISO 6498：1998，IDT）3 培养基 和材 料 实验用水参照标准：分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008/ISO 3696：1987，MOD）3.1 0.85%灭菌生理盐水 3.2 自制改良营养琼脂培养基(NA)：参见附录A 中的 A.1 3.3 革兰氏染色液：参见附录A中的A.2 3.4 细菌生化鉴定试剂盒 3.5 细菌基因组DNA提取试剂盒 3.6 标准菌株：凝结芽孢杆菌CICC21736 4 主要仪 器设 备和 玻璃 器皿 4.1 恒温培养箱：501 4.2 恒温水浴锅：801 4.3 普通冰箱 4.4 天平：感量为0.1 g、0.01 g、0.0001 g 4.5 振荡器或漩涡混合器 4.6 显微镜：1000倍 DB21/T 3278 2020 2 4.7 pH计：精确度0.1 4.8 无菌玻璃或塑料培养皿=90 mm、无菌锥型瓶、无菌玻璃或塑料涂布棒 4.9 量筒：250 mL 4.10 PCR 仪 4.11 电泳仪 4.12 凝胶成像仪 4.13 移液器：量程10 L、100 L、1000 L、10000 L 5 检验程 序 凝结芽孢杆菌检验程序见下图。DB21/T 3278 2020 3 6 采样 采集样品真实，具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应为无菌器皿。样品采集后置于48环境内保存，并应及时送到微生物检验室进行检测。采样数量和方式按GB/T14699.1执行。7 试样的 制备 按照GB/T 20195进行试样的制备，样品制备后应及时检验。8 试验步 骤 8.1 检样制 备、初始 悬液 和 10 倍稀释 以无菌操作称取试样25.0 g(mL)，注入盛有225 mL 0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中。置振荡器上，设置参数37、185 r/min，振荡60 min，制成1：10的初始悬浮液，水浴801维持10 min。吸取1：10的初始悬浮液1 mL，加入9 mL 0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1：100的稀释液。根据样品含菌量，按上述操作顺序做10倍递增稀释液。8.2 接种和 培养 选择2个适宜稀释度，每个梯度2个平行，用无菌移液器分别吸取0.1 mL稀释液，接种到自制改良营养琼脂培养基(NA)上。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面，涂布棒不应接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好，置室温中放置15 min，使菌液浸入培养基，倒置于501培养箱中培养24 h1 h。8.3 菌落计 数 培养后，选取菌落数在30个300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。典型的凝结芽孢杆菌菌落形状不规则，无隆起，呈灰白色，不透明。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。8.4 确证试 验 8.4.1 概述 目前商品化的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管以进行该项确证试验。目前商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，如果符合本标准确证试验的要求，可以按照商品说明书使用这些细菌基因组DNA提取试剂盒或常用方法以进行该项确证试验。8.4.2 菌种制 备 自凝结芽孢杆菌菌落计数平板上挑取不透明，灰白色单菌落，划线转接培养于自制改良营养琼脂培养基(NA)（A.1）上，501培养24 h1 h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。DB21/T 3278 2020 4 8.4.3 形态观 察 将挑选纯化的菌落做革兰氏染色(A.2)镜检。凝结芽孢杆菌细胞应为蓝紫色，杆状，有芽孢时，芽孢端生椭圆形，芽孢囊不明显膨大。8.4.4 生理生 化确 证试 验 将挑选纯化的单一菌落，用生化鉴定试剂盒或者生化鉴定管或者微生物鉴定仪按说明进行鉴定试验。8.4.5 生理生 化确 证结 果 凝结芽孢杆菌的主要生化特性见表1。表1 凝结芽 孢杆 菌与 其他 类似 芽孢杆 菌的 鉴别 特征 项目 凝结芽孢杆菌 B.coagulans 枯草芽孢杆菌 B.subtilis 地衣芽孢杆菌 B.licheniformis 侧孢短芽孢杆菌 B.laterosporus 短小芽孢杆菌 B.pumilus 厌氧生长-硝酸盐还原 d+-淀粉水解-明胶液化-+利用 丙酸盐-柠檬酸盐 d-产酸 D-木糖 d-L-阿拉伯糖 d-D-甘露醇 d+7氯化钠生长-注：+：阳性；-：阴性；d：部分菌株为阳性。8.4.6 PCR 确 证试 验 8.4.6.1 DNA 提取 用细菌基因组 DNA提取试剂盒或常用提取方法（参见附表 A.3）提取试样 DNA，并设置阴性、阳性对照。8.4.6.2 扩增引 物序 列 上游引物：F 5-TACGGCATTGGCAAGTATCA-3；下游引物：R 5-CGACATGATTTGGTTTTCCA-3。PCR反应体系如表2所示。预计扩增产物大小为555 bp。8.4.6.3 PCR 反应 DB21/T 3278 2020 5 反应体系见表2。表2 表2PCR 反 应体 系 程序设定如下：预变性：95 5 min；变性：95 30 s；退火：60 30 s；延伸：7230 s；终延伸：72:10 min;保温：4 30 min。步骤至的循环数设为25。8.4.6.4 电泳 用电泳缓冲液(1TAE)制备 1.0%琼脂糖凝胶，加入Gelred 染料。取5 L PCR扩增产物，进行点样。用DNA分子量标记物做参照。3V/cm5V/cm恒压电泳，电泳 30 min，电泳检测结果用凝胶成像仪记录并保存。8.4.6.5 确证结 果 当阳性对照孔出现555 bp扩增带，阴性对照孔未出现目的条带时,试验结果成立。被检样品出现555 bp扩增带，凝结芽孢杆菌阳性；未出现相应扩增带的样品判为阴性。9 结果与 报告 9.1 计算每 块平 板上 凝结 芽孢 杆菌菌 落数 计数每块平板上的凝结芽孢杆菌菌落数a，使用式(1)计算：baCA(1)式中：a计数每块平板上的凝结芽孢杆菌的菌落数；b挑取后经证实为凝结芽孢杆菌的菌落数；A挑取平板上用于验证的菌落数；C平板上所有特征菌落数。最终结果按照GB/T 8170数值修约规则修约至整数。示例：若某板上长有78 个典型菌落，从中选出做确证实验的 5 个菌落中有 4 个证实为凝结芽孢杆菌，则：试剂 使用量（L）2Es Taq MasterMix 5 上游引物（20 M）0.5 下游引物（20 M）0.5 模板（20 ng/L100 ng/L）1 dd H2O 3 总体积 10 DB21/T 3278 2020 6 按照 GB/T 8170 数值修约规则得 a 为62。9.2 样品中 凝结 芽孢 杆菌 数的 计算方 法与 报告 选择两个连续稀释度平板(每个稀释度至少有一块平板，其上经确证后的凝结芽孢杆菌菌数介于 30个300个之间)，通过式（2）计算，即为1 mL或1 g样品中含有凝结芽孢杆菌的菌数 N：)d n V(nN2 1a0.1(2)式中：N样品中凝结芽孢杆菌菌数；a所有平板经确证后的凝结芽孢杆菌菌数的总和；V平板的接种体积，单位为毫升(mL)；n1第一个稀释度的平板数；n2第二个稀释度的平板数；d第一个稀释度的稀释因子(未经稀释的液体样品的 d 值为 1)。按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可将样品的凝结芽孢杆菌菌落数记录为1.09.9乘以10的指数幂表示。报告每mL或每g样品的凝结芽孢杆菌估计数，单位CFU/g（mL）。示例1：若第一个稀释度（10-4）经确证后的菌落数为170、166和238，第二个稀释度（10-5）经确证后的菌落数为50、75和80，则：061 606 230.00003377910 3)0.1(3 0.180 75 50 238 166 1704 N 按照GB/T8170数值修约规则得出每mL或每g样品中含凝结芽孢杆菌估计数为24 000 000CFU/g（mL）或2.4107 CFU/g（mL）。示例2：若只有最后一个稀释液（10-5）经证实含凝结芽孢杆菌菌落数为150、160和180，则：5150 160 180 490163 333 3330.000003 0.1 3 10N 按照GB/T8170数值修约规则得出每mL或每g样品中含凝结芽孢杆菌估计数为160 000 000CFU/g（mL）或1.6108 CFU/g（mL）。DB21/T 3278 2020 7 A A 附 录 A（规范 性附 录）培养基 和试 剂 A.1 自制改 良营 养琼 脂培 养基(NA)A.1.1 成分 K2HPO4 1 g 乙酸钠 2.5 g MgSO4 0.1 g MnSO4 0.025 g 半胱氨酸 0.25 g 大豆蛋白胨 5 g 酵母粉 2 g 葡萄糖 5 g 溴甲酚紫 0.032 g 琼脂粉 20 g 蒸馏水 1000 mL A.1.2 制法 溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在室温时为5.5，121灭菌20 min。A.2 革兰氏 染色 A.2.1 结晶紫 染色 液 A.2.1.1 成分 结晶紫 1 g 95%乙醇 20 mL 1%草酸铵水溶液 80 mL A.2.1.2 制法 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.2.2 革兰氏 碘液 DB21/T 3278 2020 8 A.2.2.1 成分 碘 1 g 碘化钾 2 g 蒸馏水 300 mL A.2.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。A.2.3 沙黄复 染液 A.2.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.2.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.2.4 染色法 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1 min，水洗；滴加革兰氏碘液，媒染1 min，水洗；滴加95%乙醇脱色，约30 s，水洗；滴加沙黄复染液，复染1 min，水洗，待干，镜检。A.3 细菌DNA 提 取步 骤 A.3.1 细菌培 养 细菌接种于5 mL液体培养基中，37摇床（300 rpm/min）培养过夜。A.3.2 细菌收 集 取1 mL培养物于1.5 mL无菌 EP 管中，室温8000 rpm/min 离心 5 min，弃上清，沉淀重新悬浮于1 mL TE（pH8.0）中或用ddH2O。A.3.3 菌体裂 解 加入6L50mg/mL的溶菌酶，37作用 2h。再加2 mol/L NaCl 50L，10%SDS 110L，20 mg/mL的蛋白酶K 3L，50作用 3 h或 37过夜（此时菌液应为透明粘稠液体）。A.3.4 抽提 菌液均分到两个1.5 mL无菌 EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25241)，混匀，室温放置510 min，12000 rpm/min离心10 min，抽提两次（上清很粘稠，吸取时应小心）。A.3.5 沉淀 加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10 min，12000 rpm/min离心10 min。DB21/T 3278 2020 9 A.3.6 洗涤 沉淀用75%的乙醇洗涤。A.3.7 稀释 抽（凉）干后，溶于50LddH2O中，取适量作为 PCR 模板。_