饲料中色氨酸的测定 微波水解-氨基酸自动分析仪法DB15／T 2037—2020.pdf

ICS 65.120 CCS B 46 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2037 2020 饲料中色 氨酸的测 定 微波水解-氨基酸自 动分析仪 法 Determination of tryptophan in feeds microwave hydorolysis-amino acid automatic analyzer method 2020-11-30 发布 2020-12-30 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 2037 2020 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1-2020 标准 化工作 导则 第1部 分：标 准化文 件的结 构和 起草规 则的 规定 起草。本文件 由内 蒙古 自治 区农 牧业科 学院 提出。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院。本文件 主要 起草 人：宋洁、姚一 萍、王丽 芳、史培、冯小 慧、王雪 娇、张三 粉、狄 彩霞、景 宇鹏、羿静、钟华 晨、郭晨 阳、云伏雨。DB15/T 2037 2020 1 饲 料中色 氨酸的测 定 微波水 解-氨 基酸自 动分析仪 法 1 范围 本文件 规定 了饲 料中 色氨 酸含量 测定 的微 波水 解-氨基酸自 动分 析仪 法。本文件 适用 于饲 料原 料、配合饲 料、浓缩 饲料 和精 料补充 料中 色氨 酸的 测定。本 方法 定量 限：0.05%（质量分 数）。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6433 饲料 中粗 脂肪 的测定 GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动 物饲 料 试 样的制 备 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的 术 语和定 义。4 原理 饲料中 色氨 酸经 微波 碱水 解后，从蛋 白链 中释 放出 来，经 氨基 酸自 动分 析仪 测定色 氨酸 含量。5 试剂 和 材料 5.1 如无特 别说 明，本文 件所 用试剂 均为 分析 纯试 剂,水 为符 合GB/T 6682 规 定的 一级水。5.2 氢氧化 钠。5.3 盐酸：浓度 36%，优级 纯。5.4 柠檬酸。5.5 柠檬酸 钠。5.6 硼酸。5.7 乙醇。DB15/T 2037 2020 2 5.8 氢氧化 钠溶 液（500 g/L）：称取50 g 氢氧 化钠，溶于50 mL 水 中，冷却 至室 温后，定容 至100 mL，混匀。5.9 氢氧化 钠溶 液（0.1 mol/L）：称 取0.40 g 氢 氧化 钠，定容 至100 mL 水 中，混 匀。5.10 氢氧化 钠溶 液（5 mol/L）：称 取200 g 氢 氧化 钠，溶于200 mL 水 中，冷却 至 室温后，定容 至1000 mL，混匀。5.11 盐酸溶 液（6 mol/L）：取 500 mL 盐酸 加水 定容 至 1000 mL，混 匀。5.12 柠檬酸 钠缓 冲溶 液（0.12 mol/L Na+，pH=3.45）：分别称 取 11.8 g 柠檬 酸钠 和 6.0 g 柠 檬酸，溶于 500 mL 水 中，加入 乙 醇 65 mL，浓盐酸 5.6 mL，用水 定容 至1000 mL，混匀，用 6 mol/L 盐酸 溶液（5.10）或500 g/L 氢 氧化钠 溶液（5.7）调节pH 至 3.45，加 辛酸 0.1 mL。5.13 柠檬酸 钠缓 冲溶 液（0.2 mol/L Na+，pH=10.85）：称 取 19.6 g 柠檬 酸钠，3.1 g 氢氧 化钠，5.0 g 硼酸，溶 于500 mL 水中，用水 定容 至 1000 mL，混匀，用 6 mol/L 盐 酸溶 液 或 500 g/L 氢氧 化钠 溶液调 节 pH 至10.85，加 入 辛酸 0.1 mL。5.14 L-色氨 酸标 准品：纯 度不 小于 99%。5.15 L-色氨 酸标 准储 备液（1.0 mol/mL）：精确 称取 20.4 mg 色氨 酸标 准品，加 适 量水和 数 滴 0.1 mol/L 的氢 氧化 钠（5.8）溶解，用水 定容 至 100 mL，4 冷藏 保存，有 效 期1 个月。5.16 L-色氨 酸标 准工 作液（0.1 mol/mL）：准确 吸取1.0 mL 色氨 酸标 准储 备溶 液于 10.0 mL 容量瓶中，用水 稀释 至刻 度，为色氨 酸标 准上 机液，4 冷藏 保存，有 效 期 2 周。5.17 针式过 滤器：0.45 m 水 性膜。6 仪器设 备 6.1 氨基酸 自动 分析 仪。6.2 微波 消 解仪：温 度不小于 180。6.3 天平：感量 分别 为0.01 g 和0.0001 g。6.4 离心机：转 速不 低 于10000 r/min。6.5 聚四氟 乙烯 消解 管：容积 不小 于50 mL。6.6 pH 计。7 分析步 骤 7.1 试样制 备 按照GB/T 14699.1 抽 取有 代表性 试样，四 分法 缩分制 样。按GB/T 20195 制备 试 样，粉 碎后 过0.25 mm孔径筛，充 分混 匀后 装入 密封容 器中 备用。脂 肪含 量 大于4%的试样，按 照GB/T 6433 先 进行 脱脂 处理。7.2 试样水 解 DB15/T 2037 2020 3 准确称 取0.05 g 0.1 g（精确至0.0001 g）脂 肪含 量 小于4%的试样，置于 聚 四氟乙 烯 消 解管 中，加 入5 mL 氢 氧化 钠溶 液（5.9），充氮 气1 min，旋紧 密封盖 后放 入微 波 消 解仪 中进行 微波 水解。水 解 条件：功率1200 w，升 温时 间10 min，水解 温度170，水 解时 间30 min。取 出 消解 管，冷却 至室 温，将水解液 转移 至25 mL 容量 瓶，用6 mol/L 盐酸（5.10）中 和，使pH 至中 性，并用水 定 容至刻 度，10000 r/min离心10 min，经0.45 m 针式过 滤器 过滤 后 用 氨基 酸自动 分析 仪测 定。7.3 氨基酸 自动 分析 仪 色 谱条 件 氨基酸 自动 分析 仪工 作条 件和洗 脱梯 度见 表1 和表2。表1 氨基酸 自动 分析 仪工 作条 件 仪器条件 仪器参数 色谱柱 LCA K06/Na（4.6 150 mm）流动相 柠檬酸钠 A：0.12 mol/L，pH=3.45；B=0.2 mol/L，pH=10.85 检测波长（nm）570 流动相流速（mL/min）0.45 茚三酮流速（mL/min）0.25 反应器温度（）130 柱温（）74 进样体积（L）50 注：可按照不同氨基酸分析 仪的最佳工作条件进行优化。表2 氨基酸 自动 分析 仪洗 脱梯度 序号 时间（min）A（%）B（%）C（%）D（%）流速（mL/min）1 初始 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 2 15.0 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 3 15.1 0.0 0.0 0.0 100.0 0.45 4 18.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.45 5 18.1 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 6 30.1 30.0 70.0 0.0 0.0 0.45 7 30.2 30.0 70.0 0.0 0.0 0.00 注：A 为 0.12 mol/L 柠檬酸 钠缓冲液；B 为 0.2 mol/L 柠檬酸钠缓冲液；D 为20 g/L NaOH 溶液。7.4 测定 根据 氨 基酸 自动 分析 仪 色 谱条件 调整 好氨 基酸 自动 分析仪 参数，依 次吸 入0.1 mol/mL 色 氨酸 标准工作液（5.15）和制 备好 的试样 水解 液，采用 外标 法单点 校正 测定 试样 中色 氨酸含 量。7.5 平行试验 按7.27.4 步 骤对 同一 试样 进行平 行测 定。7.6 空白试验 除不称 取试 样外，均 按7.27.4 步骤 进行 测定。DB15/T 2037 2020 4 8 结果计 算 试样中 色氨 酸含 量按 式（1）计算：100106 m AV M c AXss ii.(1)式中：iX 试 样中 色氨 酸 质 量分 数，单位 为%；iA 试样 测 定液 色氨 酸的 峰面积；sc 色 氨酸 标准 工作 液的 含量，单位 为微 摩尔 每 毫 升（mol/mL）；M 色 氨酸 的摩 尔质 量，为204.2，单位 为 微 克每 微 摩尔（g/mol）；V 试 样稀 释体 积，单位 为 毫升（mL）；sA 色 氨酸 标准 工作 液的 峰面积；m 称 样量，单 位为 克（g）。计算结 果以 算术 平均 值表 示，结 果精 确至 小数 点后 两位小 数。脱脂试 样的 计算 结果 根据 脱脂率 折算 成原 样结 果。9 精密度 在重复 性条 件下 获得 的两 次独立 测定 结果 的 绝 对差 值不超 过算 术平 均值 的12%。