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ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4052 2020 小反刍兽 疫恒温扩 增检测技 术规范 Technical specification for isothermal amplification of Peste des petits ruminants 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4052 2020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生物科技有限公司、桂林市临桂区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈蕾、孙文博、吴晓东、陈艳如、廖炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。DB37/T 4052 2020 1 小 反刍兽 疫恒温扩 增检测 技术规范 1 范围 本标准规定了小反刍兽疫（PPR）的恒温核酸扩增检测技术的要求。本标准适用于小反刍兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 194892008 实验室 生物安全通用要求 NY/T 5412016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，再依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下扩增。4 试剂或 材料 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1 水：符合GB/T 6682中规定的一级水。4.2 1PBS溶液（pH 值7.4）配制见附录A.1。4.3 核酸提取试剂：a)Trizol；b)氯仿；c)75%乙醇；d)异丙醇。4.4 恒温扩增试剂盒。4.5 不含RNA酶的水：DEPC处理过的不含RNA酶的水。4.6 恒温扩增检测引物：恒温扩增检测引物表B.1。4.7 无水乙醇。4.8 微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9 离心管：1.5 mL。5 材料 及设 备 DB37/T 4052 2020 2 主要仪器设备：a)微量移液器：10 L、20 L、100 L、1 000 L；b)高速台式离心机：离心力8 000 g；c)生物安全柜；d)冰箱；e)涡旋振荡器；f)研磨管；g)荧光定量PCR 仪；h)天平：感量为0.001 g。6 样品 6.1 基本要 求 应符合GB 194892008和NY/T 5412016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。6.2 样品采 集 6.2.1 棉拭子 样品 无菌采集羊口鼻棉拭子。6.2.2 组织样 品 无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。2 8 低温运至实验室用于检测。6.2.3 环境样 品 采集与病羊相关场所的粪便、饲料、污水样品。2 8 低温运至实验室。6.3 样品处 理方 法 6.3.1 口鼻拭 子样 品处 理 口鼻拭子管6 000 g震荡45秒，取200 L进行核酸提取。6.3.2 淋巴结、脾、胸 腺等 组织 样品处 理 取0.05 g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g震荡研磨45秒，制成约10%的组织匀浆液，5 000 g离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.3 粪便、饲料 样品 处理 取1 g的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g/min震荡研磨45秒，制成约10%的匀浆液，5 000 g/min离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.4 污水样 品处 理 取200 L污水进行核酸提取。DB37/T 4052 2020 3 7 操作步 骤 7.1 RNA 的 提取 Trizol 法 7.1.1 取6.2处理后的样品向处理好的 300 L组织样品或血清中加入 800 L Trizol，重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置10 min25 min。7.1.2 加入氯仿200 L，用力振荡 30 s，室温放置 5 min。7.1.3 4，8 000 g 离心 15 min，吸取上层液体500 L 于1.5 mL离心管中。7.1.4 加入1.0 mL异丙醇，-20 沉淀RNA至少 1 h。7.1.5 4 8 000 g离心10 min，弃上清，用75%的乙醇洗涤沉淀，8 000 g离心5 min，彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于 50 L DEPC处理的灭菌水中，-20 贮存，备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成 RNA的提取。7.2 恒温核 酸扩 增 设50 L恒温核酸扩增反应体系，详见附录B.2。7.3 检测 每次反应设置阳性、阴性对照，具体反应程序见表B.3。8 结果判 定 8.1 结果判读见表1。表1 结果判 定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM UNDET 或 40 样本低于检测限，报告为阴性 2 FAM 37 判定为阳性 3 FAM 37-40 复检一次，如仍为 37-40，则判定为阴性 8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。8.3 结果参考图谱：见附录 C。DB37/T 4052 2020 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂的 配制 1PBS溶液(pH值7.4)：a)磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g；b)磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g；c)氯化钠(NaCl)：8 g；d)氯化钾(KCl)：0.2 g。加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。DB37/T 4052 2020 5 B B 附 录 B（规范 性附 录）恒温核 酸扩 增引 物、反应 液体系 与反 应条 件 B.1 恒温核 酸扩 增引 物 见表B.1。表B.1 恒温核 酸扩 增引 物 引物 序列 PRRV-F 5-ATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTTTATA-3 PRRV-R 5-TCCACATCGCTGTCGTCAGATCCATCCTCTCCT-3 PRRV-Probe 5-GTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGAC(FAM-d T)(THF)(BHQ1-d T)CTCGTGGTTCAAGCA-C3 spacer-3 注：F为FAM荧光基团标记、T为THF、B为BHQ1粹灭基团标记、3末端为C3 Spacer标记。B.2 恒温核 酸扩 增体 系 见表B.2。表B.2 恒温核 酸扩 增体 系 组分 用量 L DEPC 水 25.4 A Buffer 12.5 10 M PRRV-F 2 10 M PRRV-R 2 10 M PRRV-Probe 0.6 模板 RNA 5 B Buffer 2.5 涡旋混合并离心上述溶液，装有干粉的反应管用移液器上下吹打直至干粉溶解完全并混合均匀。DB37/T 4052 2020 6 B.3 恒温核 酸扩 增反 应条 件 见表B.3。表B.3 恒温核 酸扩 增反 应条 件 反应条件 反应温度 39 C 循环数 40 信号采集 每30 s 反应时间 20 min DB37/T 4052 2020 7 C C 附 录 C（资料 性附 录）小反刍 兽疫 恒温 扩增 检测 结果判 读 阴性对照和阳性对照见图C.1。图C.1 阴性对 照和 阳性 对照 样品检测见图C.2。图C.2 样品检 测 _
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