小反刍兽疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法DB21／T 3253—2020.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3253 2020 小反刍兽 疫病毒实 时荧光 RT-PCR 检测方法 Development the method of real-time fluorescent RT-PCR for detection of PPRV 2020-04-30 发布 2020-05-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/T 3253 2020 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 缩 略语.1 4 原理.1 5 仪 器和 器材.1 6 试 剂和 引物.2 7 操 作步 骤.2 8 试 验成 立条 件与 结果 判 定.4 9 检 测过 程中 防治 交叉 污 染的措 施.4 10 废 弃物 处理.5 DB21/T 3253 2020 II 前 言 本标准 按 照 GB/T 1.1 2009 给 出的 规则 起草。本标准 由 动 物卫 生标 准化 技术委 员 会（辽 宁）提出。本标准 由辽 宁省 农业 农村 厅归口。本 标准 起草 单位：辽 宁省农 业发 展服 务中 心、洛阳莱 普生 信息 科技 有限 公司、辽 宁佰 瑞生 物科 技 有限公司。本标准 主要 起草 人：邓 文 超、石霖、魏园 园、吴 继 阳、张皓 淳、王 冰、张 鑫、王竹、刘 金玲、董娜、高原、杨作 丰、彭潇 潇、姚伟、里里、陈 腾、胡影。本标准 发布 实施 后，任何 单 位和个 人如 有问 题和 意见 建议，均可 以通 过来 电和 来 函等方 式进 行反 馈，我们将 及时 答复 并认 真处 理，根 据实 际情 况依 法进 行评估 及复 审。归口管 理部 门通 讯地 址：辽 宁省农 业农 村厅（沈 阳市 和 平区太 原北 街2 号），联 系电 话：024-23447862；标准起 草单位 通讯 地址：辽宁省 动物及 产品 检疫中 心（沈 阳市沈 河区 万柳塘 路105号 甲），联 系 电话：024-24229579。DB21/T 3253 2020 1 小 反刍兽 疫病毒实 时荧 光 RT-PCR 检 测方法 1 范围 本标准 规定 了 小 反刍 兽疫 病毒实 时荧 光RT-PCR 检 测 方法的 技术 要求。本标准 适用 于在 生物 安全 级（BSL-2）以上的 实验 室进行 小反 刍兽 疫 病 毒病 的诊断、监 测及 流 行病学调 查，适用 于 反 刍动 物 血液 血清、淋 巴结 及口 鼻棉拭 子 中 小反 刍兽 疫 病 毒核酸 的RT-PCR 检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 19495.2-2004 转 基因产 品检 测 实验 室技 术要求 中华人 民共 和国 农业 部公 告第302 号（兽医 实验 室 生物安 全技 术管 理规 范）农业部 关于 印发 病 死及 病害动 物无 害化 处理 技术 规范 的通 知（农医 发201725 号）3 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 标准。PPRV：小反 刍兽 疫 病 毒（Peste des Petits Ruminants virus）RNA：核糖 核酸（ribonucleic acid）RNase：核 糖核 酸酶（ribonuclease）DEPC：焦炭 酸二 乙酯（diethylpyrocarbonate）bp：碱 基对（base pair）RT-PCR：反 转录 聚合 酶链 式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）dNTP：脱氧 核糖 核苷 三磷 酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）PBS：磷酸 盐缓 冲液（phosphate buffer solution）TAE：三羟 甲基 氨基 甲烷-乙酸电 泳 缓 冲液（Tris acetate-EDTA buffer）4 原理 本方法 针对 小反 刍兽 疫 病 毒高度 保守 区域 设计 特异 性引物 和探 针，在反 应体 系 中含 小 反刍 兽疫 病毒基因组 模板 的情 况下，PCR 反应 得以 进行 并释 放荧 光信号。利 用仪 器对 PCR 过程中 相应 通道 的信 号强度进行 实时 监测 和输 出，实现检 测结 果的 定性 分析。5 仪器和 器材 5.1 台式冷 冻离 心机（离 心范 围 020000r/min）5.2 冰箱：41，-20 1，-801 DB21/T 3253 2020 2 5.3 全自动 荧光 定 量PCR 仪（ABI7000、ABI7300、ABI7500、ABI7900、BIO-Rad CFX384Touch、BIO-Rad CFX96Touch 等）5.4 离心管：15 mL、1.5 mL 和0.2 mL。5.5 微量可 调移 液器：1001000 L，20200 L，10 100 L，550 L，2 20 L，0.510L，0.2 2 L。6 试剂和 引物 6.1 RNA 抽 提试 剂：Trizol 外 观为淡 粉色，于48 保 存。6.2 氯仿：-20 预 冷。6.3 异丙醇：-20 预冷。6.4 DEPC 水：去离 子水 中加 入0.1%DEPC，37作用 1h 或 室温过 夜，121 1 高压 灭菌 15 min。6.5 75%乙 醇：用无 水乙 醇和DEPC 水 配制，-20 预冷。6.6 阳性对 照：PPRV 细 胞培 养 物。6.7 阴性对 照：灭菌 水。6.8 Prime ScriptTM one Step RT-PCR kit Ver.2 试剂 盒。6.9 PBS：磷酸 盐缓 冲液（0.02 mol/L pH7.2）。6.10 引物：用 于RT-PCR 反应 的 引物浓 度 为20 mol/L。注：本标准 中使 用的试剂，除 另有说明 外，所 有实验使 用的 试剂等级 均为不 含RNA 或RNase 的分 析纯或生 化试剂；所有试剂均用 无RNA 酶污染的 无菌 的容器分装。7 操作步 骤 7.1 采样与 样品 的前 处理 7.1.1 口鼻棉 拭子 样品 采样时 要将 拭子 深入 口腔、鼻腔 来回 刮35 次，取 口腔、鼻腔 分泌 液，将拭 子放入 有 1.0mLPBS 的离心管 中备 用。7.1.2 血液或 血清 样品 采用静 脉采 血方 法，使用 无菌注 射 器 抽取 羊只 血液 样品置 于离 心管 中待 检 或 者静置 后取 上 清 待 检。7.1.3 淋巴结 样品 取少量 样品（23 g）于研 钵或匀 浆器 中研 磨,加10 mLPBS混匀，然 后将 研磨 匀 浆转入 无菌 离心 管中，4，3000 r/min离心10 min 取上 清 液 转入 无菌 的1.5 mL 离 心管 中，编号 待检。7.1.4 存放与 运输 DB21/T 3253 2020 3 采集或 处理 的样 品在28 条件 下保 存应 不超 过24h；若 需长 期保 存，应 放置-80冰 箱，但 应避 免反复冻 融（冻融 不超 过3 次）。采 集的 样品 密封 后，采用保 温壶 或保 温桶 加冰 密封，在6 8h 之内 运送 到实验室 检测。按 照 兽医 实验室 生物 安全 技术 管理 规范 进行 样品 的生 物安 全标识。7.2 荧光 RT-PCR 检测 7.2.1 RNA 提取 RNA 的 提取 可采 用手 动提 取或者 使用 商品 化试 剂盒 提取，但是 注意 提取 时设 立 阳性对 照、阴性 对 照。7.2.1.1 手动提 取RNA 的 操作 步骤 7.2.1.1.1 将750 L Trizol 加入1.5 mL 灭菌 离心 管中，然 后加 入250 L 待检 样品，颠 倒混 匀后室温静 置3 5 min。7.2.1.1.2 7.2.1.1.2 再加 入250 L 氯仿，混匀 器上 振荡 混 合 15s（或用 手反 复颠 倒 混匀），4 下1 3000r/min 离心15 min。7.1.1.1.3 小心 吸 取450 L 上 清液 转移 至装 有500 L 异丙 醇的1.5 mL 灭 菌离心 管中，颠 倒混 匀。-20 室温 静置15 min，4 1 3000r/min 离心 10 min。7.1.1.1.4 弃上 清液，加 入 1 mL 75%的DEPC 乙醇，4下 13000 r/min 离心 10 min。重 复洗 涤2 次。7.1.1.1.5 4000 r/min 离心 10s，用 微量 移液 器小 心将残 余液 体吸 干，室温 干燥 3 10 min。7.1.1.1.6 干燥 后 用20 L DEPC 水溶 解管 壁上 的 RNA，冰 上保 存备 用；若 需长期 保存 应放 置-70 冰箱。7.2.1.2 试 剂盒 提取RNA 严格按 照合法 的 商品 化RNA 提取试 剂盒 说明 书 进 行操 作。7.2.2 反应体 系的 配制 反 应 体 系 的 成 分：去 离 子 水7.5ul，上游引物PPRVF 0.5ul，下 游 引 物PPRVR 0.5ul，探针PPRVP(10umol/L)0.5ul，2 qPCR Master Mix 12.5ul，Taq 聚合 酶0.5ul，反转录 酶0.5ul，加 入PCR反应管 后震 荡离 心混 匀。7.2.3 加样 7.2.3.1 打开PCR 反 应管 盖，加 入 PCR 反 应液20 L,加 入样 本模 板5 L，阳性 对照 和 阴性对 照也 各加5 L，记录 加样 顺序。7.2.3.2 盖好 PCR 管 盖，将 PCR 反应液 与样 本模 板 振 荡混 匀后，4，2000 r/min，离心 10s。7.2.3.3 将PCR 反应 管转 移 到 PCR 区进行 上机。7.2.4 PCR 过程 7.2.4.1 开机预 热并 检验 仪器 性能。7.2.4.2 取样本 准备 区准 备好 的 PCR 反应 管，放置 在仪 器样 品槽相 应位 置，并记 录放 置顺序。DB21/T 3253 2020 4 7.2.4.3 按表1 设置 仪器 扩增 相关 参数，进 行 PCR 扩增 表1 仪器扩 增相 关参 数 体系 反应体系设为25L 信号采集 小反刍兽疫病毒FAM 通道采 集荧光信号。PCR 反应 条件 阶段 条件 循环数 反转录 50：10min 1 预变性 95：3min 1 PCR 95：5s 45 55：60s（此阶段结束时采集荧光信号）8 试验成 立条 件与 结果 判定 8.1 试验成 立条 件 阳性对 照：Ct 值30，有 明显指 数增长，呈 典型的S 型曲线。阴性 对照：Ct值43或无Ct值，线 形为直线 或轻 微斜 线，无明 显指数 增长 期和 平台 期。试验成立，参考 图如 下：8.2 结果判 定 阳性：样本 检测 结 果 Ct 值 40，有明 显指 数增 长，表明 样 本中 检测 出 该 病毒 核酸；阴性：样本 检测 结 果 Ct 值43 或无 Ct 值，表 明 样 本 中未检 测出 该病 毒 核 酸；可疑：样本 检测 结果 Ct 值在 4043 范 围，判定 为可 疑；此 时应 对样 本进 行重 复检测，如 重复 实 验结果 Ct 值 仍在 4043 范 围，有明 显指 数增 长，则判 定为阳 性，否则 为阴 性。结果分 析后 应保 存当 前的 分析结 果，记录 好阈 值和 基线。9 检测过 程中 防止 交叉 污染 的措施 DB21/T 3253 2020 5 按照GB/T 19495.2-2004 的规定 执行。10 废弃物 处理 按照 农 业部 关于 印发 病 死及病 害动 物无 害化 处理 技术规 范 的 通 知（农医 发201725 号）规 定执行。_