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ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.4 2020 新型冠 状病毒检 测技术规 范 第4 部分：重组酶 介导等温 扩增程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 4:Recombinase aided amplification test procedure 2020-03-02 发布 2020-03-03 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.4 2020 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 环 境与 设施.2 5 设 备与 耗材.2 6 试 剂与 材料.2 7 样 本前 处理 与核 酸提 取.2 8 扩 增体 系配 制与 扩增.2 9 结 果判 定.3 DB32/T 3762.4 2020 II 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分：第1部 分：生物 样本 采 集、运 输和 保存；第2部 分：病毒 分离 与 鉴定；第3部 分：核酸 荧光PCR 检测 程序；第4部 分：重组 酶介 导 等温扩 增程 序；第5部 分：血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序；第6部 分：血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序；第7部 分：空气 样 本 检 测与评 估；第8部 分：物体 表面 检 测与评 估；第9部 分：医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估。本部分 为DB32/T 3762 的第4部 分。本 部分 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本部分 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出。本部分 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。本部分 起草 单位：江 苏省 疾病预 防控 制中 心、南京 医科大 学、苏州 第五 人民 医院、苏州 大学 附二 院、昆山市 疾病 预防 控制 中心。本 部分 主要 起草 人：朱 小 娟、朱宝 立、崔 仑标、葛 以跃、程 军平、徐佳 南、钱志远、罗晓 明、沈 欢喜。DB32/T 3762.4 2020 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第4 部分：重组酶 介导等 温 扩增程序 1 范围 本 部分 规定 了新 型冠 状病 毒 实验 室核 酸 重 组酶 介导 等温扩 增检 测 的 环境 与设 施、设 备与 耗材、试 剂与材料、样 本前 处理 与核 酸提取、扩 增体 系配 制与 扩增、结果 判定。本部分 适用 于新 型冠 状病 毒实验 室核 酸重 组酶 介导 等温扩 增检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 医疗机 构临 床基 因扩 增管 理办法 原 中华 人民 共和 国 卫生部 办公 厅 医疗机 构临 床基 因扩 增检 验实验 室工 作导 则 原 中 华人民 共和 卫生 部检 验中 心 新型冠 状病 毒 实 验室 生物 安全指 南 中华 人民 共和 国家卫 生健 康 委 员会 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件 3.1 等温扩 增 isothermal amplification 在等温 条件 下，短时 间内 进行核 酸扩 增的 一种 基因 扩增方 法。3.2 重组酶 介导 等温 核酸 扩增 技术 recombinase aided amplification,RAA 一 种利用 重组酶、单 链结合 蛋白、DNA 聚 合酶在 等温 条件下（最佳 温度37）进行核 酸扩增 的技术。其 原理 为：重 组酶、单 链结合蛋 白、引 物形成复 合体扫描 双链DNA，在与 引物同源 的序列 处使双链DNA 解 旋，单 链结 合蛋 白（SSB）防止 单链DNA 复性，在 能量 和dNTP 存 在 的情况 下，由DNA 聚 合酶完成链 的延 伸，5min 15 min 就可实现仪 器扩 增。3.3 逆转录 reverse transcription,RT 由一条RNA 单 链转 录为 互 补DNA，由依 赖RNA 的DNA 聚 合酶（逆 转录 酶）来 完成，或称 反转 录。4 环境与 设施 同 本标 准 第3部分4.1 和4.2。DB32/T 3762.4 2020 2 5 设备与 耗材 5.1 设备 生物 安全柜、离心机、涡旋振 荡器、水 浴或 金属浴、核 酸提取仪、RAA 恒温震荡 离心仪、RAA 恒温核酸 扩增 检测 仪。5.2 耗材 N95 及以 上防 护口 罩、医用 无纺布 帽、护 目镜、连 体 防护服、一次 性PE 手套、一次性 手术 衣、乳胶手套、防水 靴套、微 量移 液器及 各种 配套 带滤 芯Tip 头、1.5 mL EP 管、冻存 管、冻存 盒。6 试剂 与 材料 6.1 试剂 核酸提 取试 剂盒、RT-RAA 核 酸扩 增试 剂盒。6.2 材料 消 毒 剂：75%乙 醇；有 效 氯5500mg/L 的 消 毒 液（需 每 天 新 鲜 配 制）；生 理 盐 水 或 磷 酸 盐 缓 冲 液（PH=7.4）；4%NaOH 或含1g/L 蛋白酶K 的磷酸盐 缓 冲液或0.1%二硫 苏糖 醇的 磷酸盐 缓冲 液。7 样本前 处理 与核 酸提 取 同 本标 准 第3部分7.1 和7.2。8 扩增体 系配 制 与 扩增 8.1 RT-RAA 核酸 扩增 试剂 盒 在室温 融化 后，瞬 时离 心，按 n+1 配 置反 应体 系（n=样 本数+1 管阳 性对照+1 管 阴性 对照），每 个反应 体系 配置 如下：表1 重组酶 介导 等温 扩增 反应 体系 组成 体积（L）灭菌水 12.7 缓冲液 25 上游引物（10 M）2.1 下游引物（10 M）2.1 探针（10 M）0.6 8.2 上述体 系配 置完 成后 用手 指轻弹 混匀，短 暂离 心。向反应 单元 中加 入 42.5 L 上述 混合 液，盖紧管盖，用 手指 轻弹 混匀，短暂 离心。8.3 打开反 应单 元管，管 盖内 侧加 入2.5 L 乙酸 镁。8.4 向反应 单元 管中 依次加入5 L 阴性 对照、模 板核 酸、阳性 对照，盖 紧管 盖。8.5 将反应 管移 至RAA 恒 温震 荡离心 仪 中，长 按震 荡键，39 预 处理7 min。8.6 上述程 序结 束后，把 反应 管 立即移 到RAA 恒 温核 酸扩 增检测 仪 中，点击运 行键，39运行 30 min。DB32/T 3762.4 2020 3 9 结果判 定 9.1 阳性判 断 9.1.1 反应结 束后，设 置斜 率 为 20，仪 器将 自动 进行 数据 分析，自动 呈现 判定 结果；9.1.2 10 min 内，扩 增曲 线的 斜 率 20 时判 断为 新型 冠状 病毒核 酸阳 性；否则 判断 为阴性。9.2 结果分 析 9.2.1 阳性质 控品 为阳 性；阴性 质控品 为阴 性。9.2.2 如检测 结果 不符 合 9.2.1 的 要求，该实 验视 为无 效，应检查 仪器、试 剂等 的偏 差，确 认无 误后 重新检测。_
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