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ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.2 2020 新型冠状 病毒检测 技术规范 第2 部分：病毒分 离 与 鉴定 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 2:Virus isolation and identification 2020-03-02 发布 2020-03-03 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.2 2020 I 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分：第1部 分：生物 样本 采 集、运 输和 保存；第2部 分：病毒 分离 与 鉴定；第3部 分：核酸 荧光PCR 检测 程序；第4部 分：重组 酶介 导 等温扩 增程 序；第5部 分：血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序；第6部 分：血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序；第7部 分：空气 样 本 检 测与评 估；第8部 分：物体 表面 检 测与评 估；第9部 分：医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估。本部分 为DB32/T 3762 的第2部 分。本部分 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本部分 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出。本部分 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。本部分 起草 单位：江 苏省 疾病预 防控 制中 心、南京 医科大 学、苏州 第五 人民 医院、苏州 大学 附二 院、昆山市 疾病 预防 控制 中心。本 部分 主要 起草 人：迟 莹、朱 宝立、葛以 跃、郭喜 玲、崔 仑标、程军 平、徐佳 南、钱 志远、罗晓 明、沈欢喜。DB32/T 3762.2 2020 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第2 部分：病毒分 离 与鉴定 1 范围 本 部分 规定 了 新 型冠 状病 毒感 染 临床 样本 病毒 分离 培养 环 境与 设施、设备 与 耗材、试 剂与 材料、操作步骤 和清 场与 消毒。本 部分 适用 于新 型冠 状病 毒 感染 患者 各类 临床 样本 中新型 冠状 病毒（SARS-CoV-2）的 分离 培养，其它呼 吸道 病毒 的 分 离培 养 程序 可参 照执 行。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。新型冠 状病 毒实 验室 生物 安全指 南 中华 人民 共和 国 国家 卫生 健康 委员 会 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件 3.1 细胞病 变效 应 cytopathic effect，CPE 病毒在 宿主 细胞 内大 量增 殖，导 致细 胞病 变甚 至死 亡的现 象。大多 数病 毒感 染敏感 细胞 培养 都 能 引起其显 微表 现改 变，如 细 胞聚集 成团 肿大 圆缩 脱落 及细胞 融合 成为 多核 细胞，细 胞内 出现 包涵 体，乃 至细胞裂 解等 即 细 胞病 变效 应。4 环境与 设施 4.1 实验室 资质 及级 别要 求：应符合 新 型冠 状病 毒实 验室生 物安 全指 南 的要 求，实验 室开 展新 型冠状病 毒感 染临 床样 本病 毒分离 培养 相关 活动 前，应报经 国家 卫生 健康 委批 准，取 得开 展相 应 活 动 的 资质，并 需在 生物 安全 三级（BSL-3）实验室 进行。4.2 操作人员 资 质及 防护 要求：实 验操 作人员 应 经过 生 物安全 培训 并取 得 BSL-3 实验活 动上 岗证，在身体健 康状 态良 好的 情况 下准入。操 作人 员 按 BSL-3 级实 验室 个人 防护 的要 求进行 防护，需 配 备 N95及以上 级别 防护 口罩、护 目镜 或 防护 面屏、连 体防 护服、一次 性手 术衣、一 次性 PE 手套、乳胶手套、鞋套、靴套 等 防 护装 备。5 设备 与 耗材 5.1 设备 生物安 全柜、离 心机、倒 置显微 镜、涡旋 器、CO2培养箱 等。DB32/T 3762.2 2020 2 5.2 耗材 一次性平皿、剪刀、镊子、聚四氟乙烯研磨 器（塑料）、离心管、细 胞培养瓶/细胞管、移液器、移液管、带 滤芯Tip 头 等。6 试剂与 材料 6.1 临床样 本 6.1.1 呼吸道 样本：咽 拭子、痰 液、肺 泡灌 洗液 等。6.1.2 尸体解 剖组 织样 本。6.1.3 血液样 本：病人 急性 期血 清。6.2 试剂 6.2.1 Hanks 溶 液（每毫升 含青、链霉 素 各 2000 单 位）。6.2.2 DMEM 培 养液（含 10%胎 牛血清）。6.2.3 DMEM 维 持液（含 2%胎 牛血清）。6.2.4 消化液（0.25%胰酶 和 0.025%EDTA-Na2 混合 液）。6.3 细胞 非洲绿 猴肾 传代 细胞（VERO-E6）、人肝 癌细 胞（Huh7）等。7 操作步 骤 7.1 实验前 准备 7.1.1 将实验 所需 细胞 置 37 5%CO2培 养箱 培养 至单 层。7.1.2 配备消 毒液：75%酒 精、0.55%次 氯酸 钠消 毒液。7.1.3 检查 BSL-3 级实验 室压 力 是否正 常。7.1.4 将细胞、样 本、试剂 和耗 材一次 性带 入 BSL-3 级实 验室核 心区。7.2 样 本处 理 7.2.1 呼吸道 样本 及肛 拭子 a)在 生 物安 全 柜 内 涡旋 震 荡装有 呼吸 道 样本（咽 拭 子、痰 液、肺 泡灌 洗液 等）及 肛 拭子 的采样管，瞬 时离 心后 取上 清液 至新的 离心 管，按 终 浓度 10%20%加入 青链 霉素，置 4 冰箱 处理样本 4-6 小时 或 过夜。b)将上述 处理 过的 样 本 4，4000rpm，离心 5min，以去除 杂质。7.2.2 肺组织 样 本 a)在生物 安全 柜 内 将肺 组织 放在平 皿内，取 3 mL 5mL 的 Hanks 溶 液漂 洗 3 次，以去 除组 织 外部的血 垢。漂 洗时 动作 要 轻柔，防 止气 溶胶 的产 生 和液体 的溅 出。漂 洗的 废 液收集 在 含 0.55%的次氯 酸钠 消毒 液的 带盖 塑料瓶 内。b)将漂洗 后的 肺组 织，用无 菌的剪 刀和 镊子 去除 肺组 织上的 结缔 组织 和血 管，再用 Hanks 溶液漂洗 1 次，将 肺组 织剪 成 1mm3的小块放 在研 磨器 内 进行研 磨，研 磨的 动作 要 轻柔，注 意避 免DB32/T 3762.2 2020 3 液体的 溅出。研 磨后 制成 20%悬液，按 终浓 度 10%20%加 入青 链霉 素，置 4 冰箱处 理样 本4-6 小时或过 夜。c)将上述 处理 过的 样本 管 4，4000rpm，离心 5min，以去 除杂 质。7.2.3 血液样 本 a)感染急 性期 血清，按 终浓 度 10%20%加入 青链 霉 素，置 4 冰 箱处 理样 本 4 6 小 时或 过 夜。b)将上述 处理 过的 样本 管 4，4000rpm，离心 5min，以去 除杂 质。7.3 接种病 毒 7.3.1 弃去 VERO-E6 细 胞培 养液，用 Hanks 液 洗涤 细胞 3 次，弃 上清。7.3.2 吸取 50 L L 样本液 接种至 培养 孔内，轻轻 混 匀，置 37 5%CO2 培养 箱，吸 附 1h 2h，期间 每 15min 摇晃 一次。7.3.3 吸附后 弃上 清，补足 适量 DMEM 维 持液，置 37 5%CO2培 养箱 培养，设 VERO E6 细胞对照 7.4 细胞 病 变（CPE）观察 与 培养物 收集 鉴定 7.4.1 细胞病 变（CPE）观察 按上述 方法样 本接 种 细胞 后，每24h 在 倒置显 微镜 下 观察细 胞形态 变化（CPE）：以0%25%细胞CPE 变 化为，26%50%细胞CPE 变 化为，51%75%细胞CPE 变化为，76%100%细胞CPE 变 化为，正常 细胞形 态为-。7.4.2 培养物 收集 每代次 收集 的 培 养物 需反复 冻融 三次，4，4000rpm，离心15min，收集 上清。7.4.3 培养结果 鉴定 满足以 下两 点判定 病 毒分 离成功。若 不满 足以 下条 件说明 病毒 分离 不成 功，需盲传 三代 或重 新 接 种临床样 本再 做鉴 定。a)样本接 种孔 细胞 出现 明 显 CPE(+及以 上)；b)分离培 养物 进行 新型 冠状 病毒核 酸检 测 呈 阳性。8 清场与 消毒 8.1 操作结 束后，及 时清 理生 物安全 柜内 的物 品，用 75酒精 擦拭 外表 面后，移 出生物 安全 柜。8.2 将实验 过程 产生 的所有 污 染材料 经 121，30min 高 压消毒 灭菌 处理。8.3 用新鲜 配制 的 含0.55 次 氯酸钠 溶液 擦拭 工作 台面、生 物安 全柜内 壁及 台面，不 要擦 拭顶棚，作用30min 后，用 清水 擦拭 以除去 残余 消毒 液。8.4 填写实 验记 录并 用 传 真机 传出，退出 核心 区填写 BSL-3 级 实验 室相 关实 验记 录。_
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